Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Dagliga överföringar, arkivering av populationer och mätning av kondition i det långsiktiga evolutionsexperimentet med Escherichia coli

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65342
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2,4, 1, 1, 2,3, 2,5
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin, 2BEACON Center for the Study of Evolution in Action, Michigan State University, 3Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 4Department of Integrative Biology, Michigan State University, 5Biological Sciences Program, Michigan State University

Summary

Detta protokoll beskriver hur man upprätthåller Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) genom att utföra sina dagliga överföringar och periodiska frysningar och hur man utför tävlingsanalyser för att mäta konditionsförbättringar i utvecklade bakterier. Dessa procedurer kan fungera som en mall för forskare som startar sina egna mikrobiella evolutionsexperiment.

Abstract

Long-Term Evolution Experiment (LTEE) har följt tolv populationer av Escherichia coli när de har anpassat sig till en enkel laboratoriemiljö i mer än 35 år och 77 000 bakteriegenerationer. Upplägget och procedurerna som används i LTEE sammanfattar tillförlitliga och reproducerbara metoder för att studera mikrobiell evolution. I detta protokoll beskriver vi först hur LTEE-populationerna överförs till färskt medium och odlas varje dag. Sedan beskriver vi hur LTEE-populationerna regelbundet kontrolleras för möjliga tecken på kontaminering och arkiveras för att ge en permanent frusen "fossil rekord" för senare studier. Flera skyddsåtgärder som ingår i dessa förfaranden är utformade för att förhindra kontaminering, upptäcka olika problem när de uppstår och återhämta sig från störningar utan att märkbart sätta tillbaka experimentets framsteg. Ett sätt att det övergripande tempot och karaktären av evolutionära förändringar övervakas i LTEE är genom att mäta konkurrenskraftig kondition hos populationer och stammar från experimentet. Vi beskriver hur samkulturella tävlingsanalyser genomförs och tillhandahåller både ett kalkylblad och ett R-paket (fitnessR) för beräkning av relativ kondition från resultaten. Under LTEE har beteendet hos vissa populationer förändrats på intressanta sätt, och ny teknik som helgenomsekvensering har gett ytterligare vägar för att undersöka hur populationerna har utvecklats. Vi avslutar med att diskutera hur de ursprungliga LTEE-procedurerna har uppdaterats för att tillgodose eller dra nytta av dessa ändringar. Detta protokoll kommer att vara användbart för forskare som använder LTEE som ett modellsystem för att studera kopplingar mellan evolution och genetik, molekylärbiologi, systembiologi och ekologi. Mer allmänt ger LTEE en beprövad mall för dem som börjar sina egna evolutionsexperiment med nya mikrober, miljöer och frågor.

Introduction

I februari 1988 inokulerade Richard Lenski tolv kolvar innehållande ett definierat glukosbegränsat tillväxtmedium med klonala kulturer av Escherichia coli vid University of California, Irvine1. Följande dag överförde han 1 % av kulturen från varje kolv till en uppsättning nya kolvar innehållande färskt odlingsmedium. Denna utspädning på 1:100 gjorde det möjligt för bakteriepopulationerna att expandera 100 gånger innan de uttömde den tillgängliga glukosen, vilket motsvarar ungefär 62/3 generationer av celldelningar. Denna procedur upprepades följande dag och har varit varje dag sedan dess, med några avbrott. Dessa dagliga överföringar har fortsatt, även när experimentet flyttades, först till Michigan State University 1992 och sedan till University of Texas i Austin 2022. Samtidigt har nya mutationer kontinuerligt genererat genetisk variation i dessa E. coli-populationer och naturligt urval har lett till att utvecklade celler konkurrerar ut sina förfäder.

Lenski utformade detta experiment, nu känt som Long-Term Evolution Experiment (LTEE), för att undersöka evolutionens dynamik och repeterbarhet. För att besvara dessa frågor inkluderade han flera viktiga funktioner i utformningen av den experimentella installationen och dess protokoll2. En av dessa egenskaper var det noggranna valet av en modellorganism. De ursprungliga tolv populationerna startades alla från enstaka kolonier som delade en omedelbar gemensam förfader, Escherichia coli B-stam REL606. Denna stam valdes eftersom den redan hade använts allmänt i laboratorieinställningar, reproducerats helt asexuellt och innehöll inga plasmider eller intakta profeter 3,4 - som alla gör det enklare att studera dess utveckling. Ett annat val som förenklade experimentet var att använda en mycket låg koncentration av glukos i tillväxtmediet för att begränsa tätheten av celler i varje kolv efter tillväxt. Att använda en låg celltäthet var avsett att göra det lättare att analysera förändringar i populationens kondition genom att minska potentialen för utveckling av ekologiska interaktioner inom populationer (t.ex. genom korsmatning)5.

REL606 kan inte använda ʟ-arabinos som kol- och energikälla (Ara−) på grund av en punktmutation i araA-genen . Innan LTEE påbörjades isolerades en spontan mutant med en återställd araA-sekvens , betecknad REL607, från REL6066. REL607 kan växa på ʟ-arabinos (Ara+). REL606 användes för att starta sex av LTEE-populationerna, och REL607 användes för att starta de övriga sex. Arabinos förekommer inte i det tillväxtmedium som används under LTEE, så REL607 beter sig på samma sätt som REL606 under dessa förhållanden. Men när de pläteras på tetrazolium arabinos (TA) agar bildar Ara− och Ara+ celler röda respektive vita kolonier. Denna metod för att skilja mellan de två förfäderna E. coli-stammarna och deras ättlingar är ganska användbar. Den kan användas för att upptäcka korskontaminering mellan LTEE-populationer. Det hjälper också till att mäta konditionen hos en Ara− stam eller population i förhållande till en Ara+ när de tävlas mot varandra. Kondition mäts genom att skapa en samkultur av motsatt markerade konkurrenter och sedan övervaka hur frekvenserna av röda och vita kolonier (erhållna genom att sprida utspädningar av kulturen på TA-plattor) förändras mellan när konkurrenterna initialt blandas och efter en eller flera tillväxtcykler under samma förhållanden som LTEE. Representationen av den mer passande celltypen kommer att öka under varje tillväxtcykel.

Ett annat kritiskt inslag i LTEE är att prover av de utvecklande populationerna regelbundet arkiveras. När de blandas med ett kryoskyddande medel som glycerol kan E. coli-celler frysas och senare återupplivas7. Som en del av LTEE-protokollet, var 75: e dag (vilket motsvarar ungefär 500 generationer), blandas en del av varje population som inte överfördes till en ny kolv med glycerol, delas upp mellan flera flaskor och förvaras i en frys. Denna frysta "fossila rekord" gjorde det möjligt för forskare att utföra de första studierna av LTEE, där de återupplivade de utvecklade E. coli-populationerna från olika tidpunkter och tävlade dem mot förfädernas stammar för att spåra hur snabbt konditionen ökade1. Fitnessutvecklingen har ommätts regelbundet eftersom fler "skikt" av den frysta "fossila posten" har bevarats. Den övergripande slutsatsen från dessa mätningar är att konditionen fortsätter att förbättras i LTEE till denna dag, även efter så många generationer av utveckling i samma miljö 8,9,10.

Vad har gjort det möjligt för LTEE att fortsätta så länge? Många av samma funktioner som gjorde det möjligt att ställa och besvara de ursprungliga frågorna har också fungerat som säkerhetsåtgärder och felskydd mot oundvikliga störningar på grund av otur, mänskliga fel och världshändelser. Varje dag, när kulturerna överförs till färskt tillväxtmedium, växlar forskaren som utför överföringarna mellan Ara− och Ara+ populationer. Sedan, när populationerna är frysta, kan de pläteras på selektiv och indikatoragar för att kontrollera om några "närliggande" populationer av misstag har korskontaminerats eller blandats (t.ex. vita kolonier är i en befolkning som bara ska bilda röda kolonier) eller förorenats med främmande mikrober (t.ex. oväntade kolonimorfologier eller celltätheter). I händelse av att en befolkning har äventyrats kan dess stamfader återupplivas från frysen och föras vidare i dess ställe. Ara-markörerna och det frysta arkivet tjänar således dubbla syften som både experimentella resurser och säkerhetsåtgärder.

Eftersom dess historia är så välbevarad och lättillgänglig har LTEE-prover studerats med hjälp av tekniker som inte fanns när experimentet började. Till exempel har helgenomsekvensering använts för att undersöka dynamiken hos mutationer i LTEE-populationerna 11,12,13,14,15, och transkriptomik och ribosomal profilering har använts för att undersöka förändringar i genuttryck 16,17. Genetiska verktyg har använts för att rekonstruera stammar som skiljer sig åt genom enstaka mutationer eller kombinationer av flera utvecklade mutationer för att förstå deras effekter på fitness och olika fenotyper 18,19,20,21. Prover från den frysta "fossila posten" fylls lätt på så att delar av eller hela kopior av experimentets historia kan skickas till andra laboratorier. LTEE-prover finns nu på alla kontinenter utom Antarktis, och de studeras av forskare som är yngre än själva experimentet. De robusta metoderna för LTEE och utvecklade E. coli-prover och stammar från dess historiska rekord har också fungerat som utgångspunkter för evolutionsexperiment som undersöker andra frågor och miljöer 22,23,24,25,26,27,28,29.

Figure 1
Figur 1: Översikt över LTEE-procedurer. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Här demonstrerar vi tre kärnprotokoll som används i E. coli Long-Term Evolution Experiment (figur 1). Vi beskriver: (1) hur man utför de dagliga överföringarna, (2) hur man arkiverar populationsprover och klonisolat, och (3) hur man utför och analyserar samkulturella tävlingsanalyser för att mäta konditionsskillnader. Vår förhoppning är att dessa protokoll främjar fortsatt användning av LTEE-resurser och informerar utformningen av nya mikrobiella evolutionsexperiment.

Protocol

1. Dagliga överföringar av LTEE-populationer

OBS: De tolv LTEE-populationerna överförs dagligen genom inokulering av färskt medium med 1% av kulturerna från föregående dags kolvar. Stegen i den här processen sammanfattas i figur 1. De sex Ara− -populationer som startats från stam REL606 betecknas A−1 till A−6, och de sex Ara+ -populationer som startats från stam REL607 betecknas A+1 till A+6. Strikt efterlevnad av aseptisk teknik och ett schema och order för överföring av populationerna minimerar risken för kontaminering och andra störningar.

  1. Desinficera ytan på vilken LTEE-överföringarna kommer att utföras genom att torka av den med antingen 70% etanol eller en 10% blekmedelslösning. Tänd en Bunsen-brännare för att skapa en lokal updraft och möjliggöra flammande glas.
    OBS: Använd laboratoriehandskar för att förhindra kontaminering. För säkerheten runt öppen låga är det viktigt att endast använda handskar som är gjorda av ett material som nitril som inte är brandfarligt.
  2. Bered tretton 50 ml Erlenmeyer-kolvar med borosilikat, täckta med 20 ml borsilikat- eller polypropenbägare som har tvättats och steriliserats i autoklavering. Kontrollera kolvarna för synligt skräp och byt ut alla som inte är helt rena.
  3. Märk sex flaskor A−1 till A−6 med en röd markör och de övriga sex kolvarna A+1 till A+6 med en svart markör. Märk den sista återstående kolven, som kommer att vara tom, med datum i månads-/dagformat och veckodag.
  4. Fyll var och en av de 13 kolvarna med 9,9 ml DM25-medium med en steril 10 ml serologisk pipett. Flamma mynningen på varje kolv efter att bägaren har tagits bort och använts som lock och innan bägaren sätts tillbaka. Flamma pipettens spets mellan fyllningen av varje kolv.
    OBS: Instruktioner för att göra DM25 finns tillgängliga online30. Om du använder en serologisk plastpipett, avstå från att flamma spetsen eller begränsa tiden i lågan för att undvika att smälta plasten.
  5. Ta bort föregående dags LTEE-kolvar från skakinkubatorn.
  6. Undersök varje kolv genom att hålla upp den mot ljuset för att bedöma dess grumlighet och färg, kontrollera kolvens integritet och leta efter förekomsten av främmande ämnen.
    OBS: För blotta ögat kommer alla Ara− - och Ara+ -kulturer att se något grumliga ut jämfört med ämnet, förutom A−3, som kommer att vara ~10 gånger mer grumlig än de andra på grund av tillväxt på citrat i mediet. Många externa mikrobiella föroreningar kan också växa på citrat, så ökad grumlighet i andra populationer än A-3 indikerar sannolikt kontaminering. Se avsnittet Representativa resultat för bilder av LTEE-kulturerna före en överföring.
  7. VALFRITT: Bekräfta att varje LTEE-kultur har den förväntade grumligheten genom att pipettera 1 ml av blindprovet och 1 ml av varje kultur till 1 cm plastkyvetter och ta optiska densitetsavläsningar vid 600 nm (OD600) med hjälp av en spektrofotometer efter blindning av instrumentet.
    OBS: Detta extra steg kan vara användbart för forskare som är nya på att arbeta med LTEE och är osäkra på att bedöma grumligheten med ögat, samt för att dokumentera och undersöka misstänkta avvikelser. Ta prover för mätning av OD600 från föregående dags kolvar först efter det att dagens normala överföringar till nya flaskor har slutförts (följande steg) för att minimera risken för kontaminering av de cellpopulationer som kommer att fortsätta att spridas om OD600-värdena är som förväntat. Se avsnittet Representativa resultat för typiska OD600-värden för LTEE-kulturer.
  8. Överför med hjälp av en P200-mikropipettor med steril filterspets 100 μL kultur från varje LTEE-kolv till motsvarande kolv innehållande färsk DM25. Börja med A−1 och överför sedan A+1. Därefter fortsätter du att växla mellan − och + populationerna. För att hålla reda på vilka kulturer som har överförts, skift kolvarna åt vänster efter pipettering från eller till dem.
    OBS: Den strikta ordningen för överföringar och växling mellan Ara− och Ara+ populationer hjälper till att förebygga och upptäcka korskontaminering och förväxlingar. Följ strikt aseptisk teknik: använd en ny pipettspets för varje överföring, tänd munnen på kolvarna omedelbart efter att locket har lossats och innan du tar upp det, och torka av mikropipettatorns pipa och ejektor med en luddfri pappersduk fuktad med 70 % etanol mellan varje överföring. Blekmedel bör aldrig användas för att desinficera mikropipetter, eftersom även spårmängder kan döda kulturerna.
  9. Inkubera de nyligen inokulerade kolvarna vid 37 °C i 24 ± 1 timme med 120 rpm orbital skakning över en diameter på 1 tum.
  10. Förvara kulturerna från föregående dag vid 4 °C. Behåll dessa säkerhetskopieringskulturer i två dagar. Kassera äldre kulturer som räddades vid 4 °C tre dagar tidigare vid denna tidpunkt.
    OBS: De föregående två dagarnas kulturer ger två kompletta uppsättningar säkerhetskopior för att starta om experimentet, om det behövs, om något problem eller olycka skulle inträffa, eller om kontaminering av föregående dags kulturer upptäcks före överföring (t.ex. udda färgning eller oväntade partiklar).
  11. Ange tid, datum, överföringsnummer, namn eller initialer för forskaren som gjorde överföringarna, huruvida kulturerna var okej eller inte, och annan relevant information i överföringslogganteckningsboken. Gå vidare till steg 1.12-1.14 om någon av följande situationer inträffar: (1) blindprovet från föregående dag är förorenat, (2) en kolv eller dess lock är sprucket eller trasigt, (3) en kolv innehåller främmande material, (4) en kolv välter eller tappas under överföringar, eller (5) det finns någon annan händelse eller observation som gör det tveksamt att fortsätta från dessa kolvar.
  12. Om det finns några problem, olyckor eller misstankar om kontaminering med föregående dags LTEE-kulturer, överför inte från dem. Lagra istället hela uppsättningen av tolv kulturer vid 4 ° C för senare undersökning och ytterligare karakterisering.
  13. Hämta kolvarna med de reservkulturer som överfördes från föregående dag och lagrades vid 4 °C. Placera dem på bänkskivan för att värma till rumstemperatur. Snurra försiktigt varje kolv för att återsuspendera cellerna.
  14. Överför från reservkolvarna till den nya uppsättningen kolvar som innehåller nytt medium och fortsätt försöket normalt enligt beskrivningen i steg 1.6–1.11. Anteckna i överföringsloggen att säkerhetskopieringskulturerna användes och registrera samma överföringsnummer som dagen innan.
    OBS: Även om ett problem noteras i endast en populations kolv, överför alla tolv populationer från reservkolvarna så att antalet generationer som har förflutit i alla populationer förblir i fas. Om kontaminering konstateras i reservkolvar som lagras vid 4 °C måste de berörda LTEE-populationerna åter startas från frysta lager enligt det förfarande som beskrivs i steg 3.1–3.2 för populationsprover. Överföringsnumret för LTEE bör inte ökas förrän tillväxten av de första kulturerna i DM25 efter återupplivningen.

2. Arkivering av LTEE-populationer

OBS: Prover av LTEE-populationerna fryses var 75:e överföring. Populationerna växer ~ 6 2/3 generationer varje dag efter den 100-faldiga överföringsutspädningen, så denna period motsvarar ~ 500 generationer. Under arkiveringen pläteras LTEE-populationerna också på olika typer av agarmedier för att kontrollera kontaminering. Alternativt kan representativa kloner plockas från dessa plattor och arkiveras vid denna tidpunkt. Dessa steg sammanfattas i figur 1.

  1. Dagen före den planerade frysningen eller några dagar innan, förbered tre typer av agarplattor: Minimal glukos (MG), minimal arabinos (MA) och tetrazoliumarabinos (TA). Gör tolv tallrikar av varje typ av agar, plus några extra. Förbered också minst 250 ml 0,85% (w / v) steril saltlösning och 50 ml 80% (v / v) steril glycerol.
    OBS: Recept för alla medier och lösningar finns tillgängliga online30. Dagen innan LTEE når en generation som är en multipel av 500 för det vanliga arkiveringsschemat är den 74: e dagen sedan den senaste frysningen plus eventuella dagar som lades till på grund av överföringar från 4 ° C reservkolvar när problem upptäcktes eller misstänktes.
  2. VALFRITT: Om arkivering av klonala isolat från LTEE-populationerna, förbered ytterligare leveranser: isolering av tre kloner från varje population kräver 72 MG-plattor, 80 ml 80% (v / v) glycerol och 370 ml DM1000.
  3. Förbered en extra uppsättning med tolv kolvar när du utför steg 1.2 av de dagliga LTEE-överföringarna dagen före den planerade nedfrysningen. Märk sex av de extra kolvarna xA−1 till xA−6 med en röd markör och de övriga sex xA+1 till xA+6 med en svart markör.
    Anmärkning: "X" indikerar att den extra uppsättningen kolvar kommer att användas för arkivering och skiljer dem från den andra uppsättningen kolvar som kommer att användas för att fortsätta de dagliga överföringarna av LTEE parallellt.
  4. Fyll var och en av de extra kolvarna som ska användas för arkivering med 14,85 ml DM25 med en 25 ml serologisk pipett när steg 1.4 i de dagliga LTEE-överföringarna utförs.
  5. Slutför den normala LTEE-överföringen enligt beskrivningen i steg 1.5–1.11. Upprepa sedan instruktionerna för steg 1.8, men överför den här gången 150 μL från var och en av föregående dags LTEE-kulturer till de extra kolvarna på 14,85 ml färsk DM25 som kommer att användas för arkivering.
    OBS: I detta och alla efterföljande steg, undvik kontaminering och förväxlingar genom att följa dessa riktlinjer. Börja med population A−1, överför sedan A+1 och fortsätt sedan alternerande − och + populationer. Torka av pipettatorns pipa och ejektor med en luddfri pappersduk fuktad med 70% etanol när du byter population. Skift kolvarna och provrören i sina brickor eller ställningar efter pipettering från eller till dem för att hålla reda på vilka överföringar som har slutförts.
  6. Inkubera uppsättningen med tolv kolvar för arkivering vid 37 °C i 24 ± 1 timme med 120 rpm orbital skakning över en diameter på 1 tum vid sidan av de tolv LTEE-kulturerna och blindprovet enligt beskrivningen i steg 1.9.
  7. Förbered förnödenheter för plätering av LTEE-populationerna minst en timme innan LTEE-överföringarna ska utföras på dagen för nedfrysningen.
    1. Välj tolv MG-, tolv MA- och tolv TA-agarplattor. Inspektera var och en visuellt för att vara säker på att den inte har någon uppenbar förorening.
    2. Märk en av varje typ av platta för var och en av de tolv LTEE-populationerna (A−1 till A+6).
      OBS: När du märker tallrikar, skriv på sidorna av botten av petriskålen. Detta är viktigt för att inte skymma kolonier när man vill undersöka eller fotografera dem underifrån agarn. Skriv inte på locken, eftersom dessa kan blandas ihop.
    3. Placera agarplattorna i en 37 °C inkubator i minst 20 minuter för att värma dem innan du använder dem i steg 2.10.
    4. Förbered 24 provrör innehållande 9,9 ml saltlösning. Ordna dem i tolv uppsättningar med två rör vardera.
    5. Märk var och en av de två uppsättningarna med tolv provrör på samma sätt som plattorna och lägg till en "1" eller en "2" under LTEE-populationsbeteckningen för att ange i vilken ordning de kommer att användas för utspädning av den populationen.
  8. Utför steg 1.1-1.11 med kolvarna som fortsätter de dagliga överföringarna av LTEE som vanligt. Under steg 1.5 avlägsnas även de tolv kolvarna som innehåller de extra kulturerna för arkivering från skakinkubatorn.
  9. Pipettera 100 μl av kulturen från var och en av de tolv extra kolvar som skall arkiveras i det första provröret med saltlösning i paret för den LTEE-populationen. Vortex rören med dessa 100-faldiga utspädningar noggrant. Pipettera sedan 100 μL från var och en till motsvarande andra rör med saltlösning. Virvla de sista 10 000-faldiga odlingsutspädningarna noggrant.
  10. Pipettera 80 μl från vart och ett av rören som innehåller en 10 000-faldig odlingsutspädning till de märkta TA-, MG- och MA-plattorna för den populationen. Sprid vätskan jämnt över agarytan med antingen en steril spridningsstav eller sterila spridningspärlor, beroende på vad som föredras. Upprepa tills alla tolv populationer har pläterats på alla tre typer av media.
  11. Låt vid behov plattorna torka tills ingen vätska syns på agaren. Placera plattorna upp och ned (med agarsidan uppåt) i en konvektionsinkubator inställd på 37 °C.
    OBS: Inkubationsplattor upp och ner hindrar agaren från att torka ut och förhindrar att kondens droppar på agarytan. Rörelse av celler i vätska på agarytan under inkubation kan smeta kolonier och ge felaktiga koloniantal.
  12. Tillsätt 3 ml steril 80 % (v/v) glycerol till var och en av de tolv extra kolvar som öronmärkts för arkivering. Blanda noggrant genom att virvla och försiktigt virvla.
  13. Fördela blandningen från varje kolv till sterila kryovialer som har märkts med en unik identitetsbeteckning för provet, den LTEE-population som provet tillhör, den generation då det frystes, att det är ett blandat (populations)prov och datum. Pipettera 6 ml till en stor injektionsflaska och 1,25 ml i var och en av sex små injektionsflaskor.
    OBS: Den stora injektionsflaskan är arbetsstocken. En liten injektionsflaska är en reserv om arbetsmaterialet är uttömt eller blir förorenat. De andra fem små injektionsflaskorna är kopior som kan skickas till andra laboratorier.
  14. Frys de fyllda injektionsflaskorna vid -80 °C.
  15. Undersöka och dokumentera tillväxt och morfologier hos kolonier på TA-, MG- och MA-plattorna efter 24 timmar och 48 timmars inkubation.
    OBS: Se avsnittet Representativa resultat för bilder och beskrivningar av kolonier bildade av förfäderna REL606 och REL607 och var och en av de tolv LTEE-populationerna när de pläterades på 76 000 generationer.
  16. VALFRITT: Utför följande steg när du arkiverar klonala isolat.
    1. Välj tre klonisolat (kolonier) för varje LTEE-population från MG-plattorna, stryk var och en separat på en ny MG-platta och inkubera dessa plattor i 16–24 timmar vid 37 °C.
      OBS: Om kolonier med olika morfologier är närvarande, är standardpraxis i LTEE att prova för maximal mångfald genom att först välja den vanligaste typen och sedan välja ytterligare kolonier från minoritetstyper. Man kan också använda en slumpmässig provtagningsstrategi genom att markera prickar på undersidan av botten av petriskålen innan man sprider celler och sedan plockar den isolerade kolonin närmast varje märke efter tillväxt.
    2. Nästa dag stryker du en representativ koloni från varje platta på en ny MG-platta och inkuberar dessa plattor i 16–24 timmar vid 37 °C.
    3. Inokulera följande dag en isolerad koloni från varje MG-platta i en kolv som innehåller 10 ml färsk DM1000. Fyll också ytterligare en kolv med 10 ml DM1000 för att fungera som ett oinokulerat ämne för att testa för mediekontaminering.
    4. Inkubera kolvarna vid 37 °C i 16–24 timmar med 120 rpm orbital skakning över en diameter på 1 tum.
    5. Efter inkubation tillsätts 2 ml steril 80 % (v/v) glycerol till varje kolv och virvlas runt för att blandas.
    6. Fördela 1,25 ml alikvoter från varje kolv i små, sterila injektionsflaskor märkta med en unik identitetsbeteckning för varje klon, dess LTEE-population och ursprungsgenerering, att det är ett klonprov samt datum.
    7. Frys de fyllda injektionsflaskorna vid -80 °C.

3. Konkurrenskraftiga konditionsanalyser

OBS: I LTEE kvantifieras reproduktiv lämplighet i termer av det relativa antalet fördubblingar som olika bakterier uppnår under en eller flera 24-timmars odlingscykler under samma förhållanden som de dagliga överföringarna. Specifikt är den relativa konditionen hos en konkurrent till en annan förhållandet mellan deras realiserade fördubblingshastigheter när de tävlar head-to-head i en samkultur. Varje konkurrent i ett par kan vara en hel population eller ett klonisolat som tidigare arkiverats som en del av LTEE: s frysta "fossila register". Alternativt kan en eller båda konkurrenterna vara en klon som har modifierats genetiskt för att lägga till eller ta bort specifika mutationer för att testa deras effekter. De två konkurrenterna måste ha motsatta Ara+/Ara− tillstånd eftersom denna genetiska markör används för att differentiera dem under denna analys. Det övergripande arbetsflödet för en tävlingsanalys visas i figur 2. Samodlingsfasens varaktighet kan förlängas från en till tre (eller flera) dagar för att förbättra precisionen i konditionsuppskattningar när man testar för skillnader mellan konkurrenter som är nästan jämnt matchade. Se Disussion för andra kritiska överväganden och möjliga ändringar av detta protokoll.

Figure 2
Figur 2: Flödesschema för konkurrensanalys. Den fullständiga proceduren för en endags tävlingsanalys visas. Tredagarsproceduren fortsätter med den alternativa vägen dag 1 och dag 2 fram till plätering på dag 3 på samma sätt som avbildas för dag 1 i endagstävlingen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Förbered förbrukningsmaterial
    1. Bestäm hur många konkurrerande LTEE-stammar och/eller populationer som ska användas och hur många replikerade tävlingsanalyser som ska utföras för varje par av konkurrenter. Förbered nödvändiga förnödenheter enligt beskrivningen i följande steg.
      OBS: Recept för alla medier och lösningar finns tillgängliga online30. De flaskor och provrör som krävs för alla dagar av ett tävlingsexperiment kan fyllas på i förväg eller vid behov de dagar de kommer att användas. Om kolvar och provrör fylls i förväg, förvara dem vid rumstemperatur i mörkret för att minimera avdunstning. TA-plattor måste förberedas minst två dagar före när de ska användas så att de kan torka tillräckligt efter hällning för att möjliggöra spridning av odlingsutspädningar. Förbered alltid några extra kolvar, provrör och TA-plattor så att ett experiment kan fortsätta om det finns pipetteringfel, förorenade plattor eller andra mindre missöden.
    2. För väckelsedagen (dag −2), fyll en steril 50 ml Erlenmeyerkolv täckt med en 20 ml bägare med 9,9 ml antingen DM1000 eller lysogeny buljong (LB) per stam eller population av E. coli som kommer att användas som konkurrent. Fyll ytterligare en kolv med 9,9 ml av samma medium för att fungera som ett oinokulerat blindämne.
    3. För förkonditioneringsdagen (dag −1), fyll ett provrör med 9,9 ml 0,85% (w/v) steril saltlösning per konkurrent, två kolvar med 9,9 ml DM25 per replikatanalys mellan ett par konkurrenter och ytterligare en kolv med 9,9 ml DM25 för ett blindämne.
    4. För den dag tävlingen börjar (dag 0), fyll en kolv med 9,9 ml DM25, fyll ett provrör med 9,9 ml 0,85% (w/v) steril saltlösning och förbered en TA-platta per tävlingsanalysreplikat. Fyll ytterligare en kolv med 9,9 ml DM25 för att fungera som ett blindämne.
    5. ALTERNATIV: För varje dag av en flerdagarstävling förbi den första, fyll en kolv med 9,9 ml DM25 per tävlingsreplikat och fyll ytterligare en kolv med 9,9 ml DM25 för ett ämne.
    6. För tävlingens sista dag (t.ex . dag 1 eller dag 3), fyll två provrör med 9,9 ml 0,85% (w/v) steril saltlösning och förbered en TA-platta per tävlingsreplikat.
  2. Dag −2: Återuppliva konkurrenter separat i DM1000 eller LB
    1. För var och en av de tävlande, märk en kolv fylld med 9,9 ml av antingen DM1000 eller LB. Märk en extra kolv fylld med 9,9 ml från samma parti medium för att fungera som ett oinokulerat blindprov för att testa för kontaminering.
      OBS: Frysta lager återupplivas i LB eller DM1000 för mer enhetlig och förutsägbar återvinning av kryokonserverade celler. Glycerolen som används som kryoskyddande medel kan metaboliseras av E. coli, vilket kommer att leda till högre celldensiteter än förväntat om prover återupplivas i DM25. LB och DM1000 stöder tillväxt till så höga celldensiteter att denna komplikation blir försumbar.
    2. Ta ut kryovialerna som innehåller de frysta lagren av konkurrerande stammar ur frysen på −80 °C. Håll injektionsflaskorna kylda i en ishink medan du använder dem.
    3. Efter att varje fryst lager har tinat, virvla det noggrant för att återsuspendera E. coli-cellerna. Om en klon återupplivas, ympa kolven innehållande färskt medium med 12 μl av det frysta materialet. Om en population återupplivas, inokulera kolven med 120 μl av det frysta materialet.
      OBS: Volymen på 120 μl av det frysta beståndet används för populationer så att antalet celler som återupplivas är ungefär detsamma som den dagliga flaskhalsen när 1% av LTEE-populationen överförs till en ny kolv. Upptining och virvling av frysta bestånd flera gånger kan stressa celler och minska beståndens livskraft över tid. Om en viss LTEE-population eller klon ska användas i tävlingar flera gånger är det god praxis att växa igen och frysa flera kopior av beståndet så att ingen enda tinas och fryses in många gånger.
    4. Inkubera revivalkolvarna och blindprovet vid 37 °C över natten (16–24 timmar) med 120 rpm orbital skakning över en diameter på 1 tum.
  3. Dag −1: Förhandstävlande tävlande separat i DM25
    1. För varje konkurrent, märk ett provrör fyllt med 9,9 ml saltlösning. För varje replikat av konkurrensanalys mellan ett par konkurrenter, märk två 50 ml kolvar fyllda med 9,9 ml DM25, var och en med replikatnumret och namnet på en av konkurrenterna. Märk ytterligare en kolv fylld med 9,9 ml DM25 för att fungera som ett blindämne.
    2. Ta kolvarna som innehåller kulturerna av återupplivade konkurrenter ur inkubatorn. Undersök deras grumlighet med ögat för att bekräfta att de växte och att det inte finns någon uppenbar förorening.
    3. Överför med pipett 100 μl från varje kolv till provröret med saltlösning för konkurrenten.
      OBS: Detta steg späder kulturen 100 gånger, vilket är nödvändigt eftersom cellernas densitet är mycket högre i LB och DM1000 än i DM25-miljön som används i LTEE (se representativa resultat).
    4. Virvla varje utspädningsrör noggrant precis innan 100 μl pipetteras från den utspädda kulturen till en kolv med färsk DM25. Inokulera två av dessa förkonditioneringskolvar för varje replikattest, en för var och en av de tävlande.
    5. Inkubera förkonditioneringskolvarna och blindprovet vid 37 °C i 24 ± 1 timme med 120 rpm orbital skakning över en diameter på 1 tum.
  4. Dag 0: Börja tävlingen genom att blanda tävlande och plåt för inledande räkning
    1. För varje replikat av tävlingsanalysen, märk en kolv fylld med 9,9 ml DM25 och ett provrör fyllt med 9,9 ml saltlösning. Märk kolvarna och rören på ett sätt som unikt identifierar varje par av konkurrenter och replikatnumret för tävlingsanalysen. Märk ytterligare en kolv fylld med 9,9 ml DM25 för att fungera som ett blindämne.
    2. Ta ut förkonditioneringskolvarna ur inkubatorn. Undersök deras grumlighet med ögat för att bekräfta att de växte och att det inte finns någon uppenbar förorening.
    3. Överför 50 μL av Ara− -konkurrenten till den första replikatkolven fylld med färsk DM25. Överför omedelbart 50 μL av Ara+ -konkurrenten till samma tävlingskolv och blanda den genom att snurra försiktigt.
    4. Upprepa steg 3.4.3 för alla replikat av alla par av konkurrenter.
      OBS: Tävlingskolvarna har nu en total 100-faldig utspädning av E. coli-kulturer odlade i DM25, samma tillståndsceller i LTEE-upplevelsen efter varje daglig överföring. Ordningen för att utföra överföringar och blandning är viktig. Tillsätt båda konkurrenterna till varje kolv omedelbart efter varandra så att ingen av dem får ett försprång att växa i det färska mediet. Lägg till exempel inte till Ara− -kulturerna till alla tävlingskolvar och gå sedan tillbaka och lägg till alla Ara+ -stammarna.
    5. Pipettera 100 μl från varje nyligen inokulerad tävlingskolv till provröret med saltlösning märkt för den tävlingsanalysen så att vart och ett av dessa rör innehåller en total 10 000-faldig utspädning av de förkonditionerade DM25-kulturerna som kombinerades.
    6. Placera tävlingskolvarna och ämnet i skakinkubatorn. Inkubera tävlingskolvarna vid 37 °C i 24 ± 1 timme med 120 rpm orbital skakning över en diameter på 1 tum.
    7. Samma dag, omedelbart efter att tävlingskolvarna placerats i inkubatorn, virvla varje provrör från steg 3.4.5 noggrant och sprid 80 μL av dessa 10 000-faldiga utspädningar på TA-plattor enligt beskrivningen i steg 2.10. Märk sidan av botten av varje platta med det par stammar som blandades, replikatnumret och "Dag 0" för att indikera att det kommer att användas för att bestämma den ursprungliga representationen av varje konkurrent.
    8. Inkubera TA-plattorna upp och ner i en gravitationskonvektionsinkubator vid 37 °C tills kolonier hos både Ara−- och Ara+-konkurrenterna är synliga och urskiljbara. I allmänhet sker detta inom 16-24 timmar, men det kan ta längre tid för vissa utvecklade stammar. Räkna antalet Ara− (röda) och Ara+ (vita) kolonier på varje platta ochregistrera resultaten.
      OBS: Skillnaderna mellan färgerna på Ara- och Ara+-kolonierna på TA-plattorna blir mindre tydliga med tiden, även när plattorna förvaras vid 4 °C, så de måste räknas så snabbt som möjligt när de har tagits ut ur inkubatorn. Bilder av TA-plattor som visar det typiska utseendet på kolonier bildade av Ara−- och Ara+-celler ingår i de representativa resultaten. Det avsnittet har också bilder av vanliga "kantfall" -kolonier (t.ex. överlappning eller utväxt av olika kolonityper) och förklarar hur man räknar dem. Om tillväxthastigheterna och morfologierna hos kolonier som bildas på TA-plattor av någon av konkurrenterna inte tidigare har karakteriserats, sprid 80 μL av en 10 000-faldig utspädning i saltlösning från förkonditioneringskolvarna dag 0, när konkurrenterna fortfarande är åtskilda från varandra. Undersök sedan kolonierna på dessa kontrollplattor efter inkubation vid 37 °C i 16–24 timmar eller längre.
  5. ALTERNATIV: Dag 1 och 2: Fortsätt tredagarstävlingen
    1. För varje replikat av tävlingsanalysen märks en kolv fylld med 9,9 ml DM25. Märk kolvarna på ett sätt som unikt identifierar varje par av konkurrenter, replikatnumret och tävlingsdagen. Märk ytterligare en kolv fylld med 9,9 ml DM25 för att fungera som ett blindämne.
    2. Ta ut tävlingskolvarna från föregående dag ur inkubatorn. Undersök deras grumlighet med ögat för att verifiera förväntad tillväxt och upptäcka kontaminering.
    3. Överför 100 μl från varje tävlingskolv till motsvarande kolv med färskt medium för nästa tävlingsdag.
    4. Placera de nya tävlingskolvarna och ämnet i skakinkubatorn. Inkubera dem vid 37 °C i 24 ± 1 timme med 120 rpm orbital skakning över en 1-tums diameter.
    5. Upprepa steg 3.5.1-3.5.4 på tävlingens dag 2 innan du fortsätter.
  6. Dag 1 eller 3: Sluttävling och tallrik för sluträkning
    1. Förbered två provrör fyllda med 9,9 ml saltlösning för varje tävlingskolv. Märk dem på ett sätt som unikt identifierar varje par av konkurrenter, replikatnumret och om de är för den första eller andra utspädningen.
    2. Ta ut tävlingskolvarna ur inkubatorn. Undersök deras grumlighet med ögat för att upptäcka att de växte och att det inte fanns någon uppenbar förorening.
    3. Överför med pipett 100 μl från varje tävlingskolv till det första röret med saltlösning för replikatet. De resulterande rören innehåller 100-faldiga utspädningar av DM25-kulturerna.
    4. Virvla varje 100-faldigt utspädningsrör för att blanda det noggrant och pipettera 100 μL till det andra röret med saltlösning för replikatet. De resulterande rören innehåller 10 000-faldiga utspädningar av DM25-kulturerna.
    5. Virvla varje provrör som innehåller en 10 000-faldig utspädning noggrant och sprid 80 μL av det på en TA-platta enligt beskrivningen i steg 2.10. Märk sidan av botten av varje platta med paret av stammar som blandades, replikatnumret och "Dag 1" för en endagstävling eller "Dag 3" för en tredagars tävling för att indikera att den kommer att användas för att bestämma den slutliga representationen av varje tävlande.
    6. Inkubera TA-plattorna vid 37 °C och räkna Ara−- och Ara+ -kolonierna efter tillväxt enligt beskrivningen i steg 3.4.8.
      OBS: Håll koll på replikatnumret för varje tävlingsanalys under alla överförings- och pläteringssteg. Att förvirra vilka slutliga och initiala räkningar som motsvarar olika replikatanalyser - även när samma två konkurrenter blandades i var och en - kommer att resultera i felaktiga konditionsuppskattningar.
  7. Beräkning och plottkondition
    1. Om du använder Excel för att beräkna och plotta relativ kondition, ladda ner XLS-kalkylbladet (kompletterande fil 1). Om du använder R installerar du fitnessR-paketet31 och laddar ned mallen för kommaavgränsade värden (CSV) (tilläggsfil 2) eller genererar en ny kopia av den här filen enligt anvisningarna i vinjetten.
    2. Ange en "överföringsutspädning" på 100 för tävlingsanalyserna som utförs i den angivna cellen eller kolumnen i den nedladdade filen. Ange det totala antalet dagliga tillväxtcykler under vilka konkurrenterna samodlades som "antal överföringar" (t.ex. 3 för en tredagarstävling).
    3. Ange namnen på varje par av konkurrenter i de angivna cellerna eller kolumnerna med referensstammen som "konkurrent1" och teststammen eller populationen som "konkurrent2".
    4. För varje replikat av tävlingsanalysen anger du respektive första och slutliga koloniantal i de angivna kolumnerna i den nedladdade filen.
    5. Om du använder Excel-kalkylbladet visas nu medelvärdet för relativ kondition och 95 % konfidensgränser för denna uppskattning. Kopiera resultaten för olika kombinationer av konkurrenter till ett annat ark och skapa ett diagram som sammanfattar resultaten. Om du använder R för att analysera data följer du anvisningarna i vinjetten för fitnessR-paketet för att utföra dessa beräkningar, mata ut en CSV-fil med de beräknade värdena och rita resultatet.

Representative Results

Utseende och grumlighet hos LTEE-kulturer
På grund av den låga glukoskoncentrationen i DM25 är grumligheten hos fullvuxna LTEE-populationer endast knappt synlig i elva av de tolv kolvarna. Vid undersökning av LTEE-kulturerna med avseende på normal tillväxt och tecken på kontaminering (steg 1.6) ska varje kolv som innehåller en LTEE-population jämföras sida vid sida med blindprovet (figur 3A). Undantaget är population A−3, som utvecklats för att använda citrat som en extra kol- och energikälla och därför når en högre celldensitet32. Grumligheten hos DM25-kulturerna i REL606- och REL607-förfäderna liknar den hos en typisk utvecklad population (figur 3B). LTEE-stammar och populationer växer till en högre densitet i DM1000 på grund av den högre koncentrationen av glukos och en mycket högre densitet i LB (figur 3B). Tätheten av DM25-kulturer i A-3 LTEE-populationen är mellanliggande mellan densiteterna hos kulturer av REL606 i DM25 och DM1000 (figur 3C).

Figure 3
Figur 3: Utseende av LTEE-kulturer. (A) Flaskor som innehåller de tolv LTEE-populationerna efter 24 timmars tillväxt i DM25 den dag då experimentet nådde 76 253 1/3 generationer avbildas bredvid ämnet. b) Flaskor som innehåller kulturer av förfäderna REL606 och REL607 som odlats under 24 timmar i DM25, DM1000 och LB avbildas tillsammans med medieämnen. (C) Inzoomade bilder av samma kolvar sida vid sida som visar hur grumligheten hos A-3-populationskollegiet i DM25 jämförs med REL606-förfadern i DM25 och DM1000. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Spektrofotometeravläsningar av de optiska densiteterna vid 600 nm (OD600) för kulturer odlade i DM25 (steg 1.7) matchar dessa visuella observationer för både LTEE-populationerna (figur 4A) och deras förfäder (figur 4B). Dessa avläsningar kan användas för att kvantitativt jämföra och dokumentera tillväxt när kontaminering eller ett misstag misstänks. För mätningar av LTEE-populationerna mellan 76 000 och 76 500 generationer fann vi att OD600 av A-3, populationen som utvecklades för att växa på citrat, var 0,223 i genomsnitt (0,218-0,227, 95% konfidensintervall). OD600 för de övriga elva populationerna var i genomsnitt 0,0252 (0,0239-0,0265, 95% konfidensintervall). Det fanns liten, men signifikant variation i OD600-avläsningar bland de elva normala populationerna (F 10,88 = 5,1035, p = 7,5×10−6). LTEE-populationerna når stationär fas efter ungefär 5-6 timmars inkubation. Om de överförs på morgonen kommer tillväxten att vara synlig vid mitten till sen eftermiddag samma dag. Många arter av mikrober kan växa aerobt på citrat. Därför är ökad grumlighet i andra populationer än A-3 sannolikt ett tecken på yttre kontaminering.

Figure 4
Figur 4: Grumlighet hos LTEE-kulturer . (A) Optisk densitet vid 600 nm (OD600) hos de tolv LTEE-populationerna efter 24-timmars tillväxtcykel på tre olika dagar mellan 76 000 och 76 500 generationer av experimentet. OD600-värdena för tre 1 ml alikvoter på var och en av de tre olika dagarna ritas som punkter. Det genomsnittliga OD600-värdet för tre olika alikvoter av blankprovet från samma dag subtraherades från dessa värden. Fyllda staplar visar medelvärden. Felstaplar är 95% konfidensgränser. (B) OD600 av kulturer av REL606 och REL607 förfäder i DM25, DM1000 och LB. OD600-värdena för tre 1 ml alikvoter på var och en av tre olika dagar i två separata kulturer för varje tillstånd och stam ritas som punkter. Det genomsnittliga OD600-värdet för tre olika alikvoter av blankprovet från samma dag subtraherades från dessa värden. Fyllda staplar visar medelvärden och felstaplar är 95% konfidensgränser. Gråskuggade områden mellan panelerna visar hur OD600-axeln skalas om mellan DM25-panelen och DM1000- och LB-panelerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tillväxt och morfologi hos LTEE-kolonier
Vid kontroll av populationerna för kontaminering genom plätering av dem på olika medier (steg 2.15) bildar förfäderna REL606 och REL607 och alla utvecklade populationer vita kolonier med genomskinliga och något oregelbundna kanter på agarplattor med minimal glukos (MG) (figur 5A). Sammansättningen av MG-agar är densamma som för DM25 som används i de dagliga LTEE-överföringarna, förutom med en högre koncentration av glukos, så de utvecklade LTEE-populationerna bildar ofta större kolonier på MG än förfäderna. På grund av dess högre celldensitet i DM25 kommer A-3-populationen att ha flera gånger fler kolonier om samma volym pläteras för den som för de andra populationerna, och detta kan begränsa koloniernas storlek. De vanligaste typerna av förorenande mikrober bildar starka vita, ogenomskinliga och perfekt cirkulära kolonier på MG.

På minimal arabinos (MA) agar bildar REL607-förfadern och Ara+ -populationerna vanligtvis alla något genomskinliga vita kolonier. Detta typiska tillväxtmönster har kvarstått för Ara+ -populationerna genom 76 000 generationer, förutom A + 6, som har utvecklat en defekt i tillväxt på arabinos och inte längre bildar kolonier på MA (figur 5B). Det finns inget urval för att upprätthålla tillväxten på arabinos under LTEE-överföringarna i DM25, så andra Ara+ -populationer kan också så småningom sluta bilda kolonier på MA-agarplattor när experimentet fortsätter. Med undantag för A−3 bildar Ara− -populationerna inte kolonier på MA-agar, även om noggrann undersökning kan avslöja mikrokolonier på grund av spårnäringsämnen i agaren. A-3-populationen bildar många små kolonier på MA, eftersom dessa celler kan växa på citratet som också finns i detta medium. Förorenande kolonier på MA är sällsynta.

Figure 5
Figur 5: Plätering av LTEE-populationer för att upptäcka kontaminering. Utspädningar av förfäderna REL606 och REL607 och de tolv LTEE-populationerna den dag då experimentet nådde 76 026 2/3 generationer pläterades på (A) MG, (B) MA och (C) TA-agarplattor och fotograferades efter 24 timmar och 48 timmar. Samma utspädningar gjordes för alla kulturer, men hälften så mycket volym pläterades för förfäderna som beskrivs i protokollet för LTEE-populationerna, för att något förklara deras högre celltätheter. Klicka här för att se en större version av denna figur.

På tetrazolium arabinos (TA) agar förväntas REL606-förfadern och alla Ara-populationer bilda röda kolonier, medan REL607-förfadern och alla Ara+-populationer i allmänhet bör bilda kolonier som är vita (vilket kan inkludera ljusrosa eller persika nyanser) (figur 5C). LTEE-förfäderna bildar robusta kolonier, som lätt kan identifieras som Ara− och Ara+ på TA-agar inom 16-24 timmar. Ursprungligen kunde denna skillnad användas för att upptäcka korskontaminering mellan Ara− och Ara+ populationer. TA-agar har emellertid en mer komplex näringssammansättning än det kemiskt definierade DM25-mediet som används i de dagliga överföringarna, och det har inte funnits något evolutionärt tryck för E. coli i LTEE för att upprätthålla en förmåga att växa robust under dessa förhållanden. Följaktligen uppvisar vissa utvecklade LTEE-populationer nu dålig tillväxt på TA-plattor, det tar 48 timmar att bilda kolonier eller växer inte på ett tillförlitligt sätt alls. Färgerna och morfologierna hos kolonier som bildades på TA av de utvecklade LTEE-populationerna har också förändrats i förhållande till förfäderna och avvikit från varandra. Förekomsten av några avvikande kolonier är inte alltid en indikation på kontaminering. Spontana mutationer kan uppstå som växlar Ara-markörtillståndet för LTEE-stammar, särskilt från Ara+ till Ara− på grund av den högre sannolikheten för funktionsförlustmutationer som påverkar arabinosanvändning jämfört med reversionsmutationer som återställer araA-aktivitet. Mutationer som byter Ara-markörtillstånd är vanligare i populationer som har utvecklat hypermutation (A−1, A−2, A−3, A−4, A+3 och A+6)13. På TA-agar bildar förorenande mikrober av andra arter ofta (men inte alltid) små, perfekt cirkulära kolonier med röda centra ringade av distinkta vita gränser som skiljer sig från de som bildas av LTEE-stammar eller populationer.

Resultat från samkulturtävlingar
Tävlingar mellan alla Ara−- och Ara+-par av de två LTEE-förfäderna (REL606 respektive REL607) och A−5- och A+5-populationsproverna arkiverade vid 20 000 generationer (REL8597 respektive REL8604) visar hur kolonier med olika Ara-markörtillstånd kan differentieras och räknas på TA-agar (steg 3.4.8 och 3.6.6) (Figur 6). Kolonier räknades för sex replikatkolvar för varje par konkurrenter före och efter en- och tredagarsanalyser som började med återupplivning i DM1000 (tabell 1). Det totala antalet kolonier som observerats för samma utspädning och volympläterade varierar med vilka konkurrenter blandades eftersom kulturer av utvecklade LTEE-populationer når lägre celldensiteter än kulturer av förfäderstammarna i DM25. Denna skillnad är en följd av utvecklingen av ökad cellstorlek, som inträffade i alla LTEE-populationer under de första tusen generationerna av experimentet 8,33.

Figure 6
Figur 6: Tävlingstester pläterade på TA-agarplattor. Exempel på TA-agarplattor från tävlingsanalyser. REL606 och REL607 är Ara− respektive Ara+ förfäder till LTEE. REL8597 och REL8604 är de 20 000 generationerna A−5 respektive A+5 från LTEE:s frysta "fossila register". TA-plattor motsvarande en replikatanalys mellan varje par av stammar visas för dag 0, dag 1 och dag 3 av tävlingen. Plattorna fotograferades efter 24 timmars tillväxt vid 37 °C. Celler från konkurrenterna REL606 och REL8597 är Ara− och bildar röda kolonier. Celler från konkurrenterna REL607 och REL8604 är Ara+ och bildar vita kolonier. Klicka här för att se en större version av denna figur.

De flesta kolonier på en typisk tävling TA-platta kommer att vara väl separerade eller överlappa på sätt för vilka det är lätt att räkna hur många ursprungligen cirkulära kolonier av olika typer som växte ihop (figur 7A). Vissa situationer kan emellertid uppstå där det inte är uppenbart hur man räknar en atypisk koloni eller tillväxt som är en blandning av de två färgerna. För det första, när en vit Ara+ koloni och en röd Ara− koloni överlappar varandra, tenderar Ara+ kolonin att växa över och omsluta Ara− kolonin. I denna situation bör man räkna en liten röd fläck eller genomskinlig "lucka" i den större Ara+ -kolonin som en Ara− koloni (Figur 7B). För det andra kommer spontana Ara+ -mutanter ibland att uppstå i Ara− kolonier. Dessa mutanter uppträder vanligtvis som vita sektorer (papiller) som sprider sig snabbare ut ur det inre av en röd koloni eftersom de växer snabbare när de får tillgång till arabinos som ett extra näringsämne (figur 7C). Dessa vita kolonier räknas som en Ara− koloni och inga Ara+ kolonier. Denna situation blir vanligare om plattorna inkuberas i 48 timmar eller längre. För det tredje observeras ibland genomskinliga rosa kolonier (figur 7D). Dessa bildas av Ara-konkurrenten. Slutligen växer ibland ett litet antal cirkulära kolonier med interiörer som har en något annorlunda nyans av rött på TA-plattor när de förorenas av några få yttre mikrobiella celler under beredningen av agar eller när de sprider odlingsutspädningar på sina ytor (figur 7E). Dessa föroreningskolonier bör inte räknas. Om kontaminering av en tävlingskultur misstänks på grund av att det finns många atypiska kolonier på någon av dess TA-plattor, bör detta replikat uteslutas.

Figure 7
Figur 7: Kantfall som påträffades vid räkning av Ara− - och Ara+ -kolonier på TA-agar. I varje panel är några Ara− och Ara+ kolonier som ska räknas markerade med solida röda respektive svarta pilar. Kolonier som inte ska räknas indikeras med streckade pilar som motsvarar den typ som de verkar vara. Alla bilder togs efter 24 timmars inkubation utom i panel C. (A) Exempel på normala Ara− och Ara+ kolonier. (B) Exempel på Ara+ -kolonier som växer över närliggande Ara-kolonier , inklusive en som bara knappt syns som ett genomskinligt gap i utsidan av den vita kolonin. Räkna vart och ett av dessa fall som två kolonier, en av varje typ. (C) Exempel på Ara− -kolonier som ger upphov till Ara+ mutanta sektorer. Räkna varje fall som endast en enda Ara− koloni. Den vita sektorn (papillen) som uppstår beror på att en Ara+ -mutant uppstår inom kolonin. Samma fält av kolonier visas efter 24 timmar, 48 timmar och 72 timmars tillväxt. (D) Exempel på en genomskinlig rosa koloni. Räkna det som Ara−. (E) Exempel på kolonier som bildats genom yttre kontaminering av en mikrob som inte är E. coli. Dessa är röda men mindre och perfekt cirkulära med en distinkt vit gräns. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Analys av antalet kolonier från dessa tävlingar med hjälp av Excel-kalkylbladet (Supplemental File 1) eller genom att köra fitnessR-paketfunktionerna i R på koloniantal som anges i CSV-mallen (Supplemental File 2) visar att de två förfäderna är oskiljbara när det gäller deras lämplighet inom analysens precision, att både 20 000-generationens A−5- och A+5-populationer är betydligt mer passande än förfäderna, och att ingen av de utvecklade populationerna är signifikant mer passande än den andra (Welchs t-test, s > 0.05) (figur 8). Precisionen i den relativa konditionsuppskattningen förbättras i tredagarstävlingarna jämfört med endagstävlingarna för ett av de tätt matchade paren (REL606 vs. REL607). Precisionen i dessa mätningar kan ökas ytterligare genom att genomföra längre tävlingar med fler tillväxtcykler, om så önskas. Resultaten från flerdagarstävlingar är dock inte informativa när en tävlande blir så riklig i förhållande till den andra efter de extra tävlingsdagarna att förhållandet mellan de två stammarna inte kan bestämmas exakt eftersom det finns väldigt få eller inga kolonier av den mindre passande typen att räkna. Detta är fallet för förfädernas tredagarstävlingar mot de utvecklade 20 000 generationspopulationerna (REL606 jämfört med REL8604 och REL607 mot REL8597) (figur 6 och tabell 1).

Tabell 1: Koloniantal från tävlingskonditionsanalyser. Endags- och tredagars tävlingsanalyser med sex replikat utfördes för alla parvisa kombinationer av två Ara− och de två Ara+ -konkurrenterna. REL606 och REL607 är Ara− respektive Ara+ förfäder till LTEE. REL8597 och REL8604 är de 20 000 generationerna A−5 respektive A+5 från LTEE:s frysta "fossila register". Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Figure 8
Figur 8: Relativ kondition mätt med tävlingsanalyser. Resultat av en- och tredagars tävlingsanalyser mellan LTEE-förfäder och de 20 000 generation A−5- och A+5 LTEE-populationerna. Diagrammet till vänster visar de fyra parvisa tävlingarna som färgkodade dubbelriktade pilar. Varje kombination av de två Ara− (röda etiketterna) och de två Ara+ (svarta etiketterna) konkurrenterna testades med sexfaldig replikering. Koloniantal från tabell 1 analyserades i R med fitnessR-paketet31 och resultaten plottades med ggplot2-paketet (version 3.4.0)34. Fitness visas som den konkurrent som pilen i etiketten går mot i förhållande till konkurrenten pilen kommer från (t.ex. REL8604 i förhållande till REL606). Relativa konditionsvärden uppskattade från koloniräkningarna för varje tävlingsanalys replikerar (poäng), genomsnittliga relativa konditionsvärden för paret av konkurrenter (staplar fyllda med samma färgkodning som diagrammet) och 95% konfidensintervall (felstaplar) visas. Relativa konditionsvärden kunde inte bestämmas (N.D.) för de tre dagars tävlingarna mellan förfäderna och de utvecklade populationerna eftersom det fanns noll eller mycket få kolonier av förfäderna på dag 3-plattorna (se tabell 1). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande fil 1. Excel-kalkylbladsfil för beräkning av relativ kondition. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2. Indatafilsmall för kommaavgränsade värden för beräkning av relativ kondition i R med hjälp av fitnessR-paketet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

LTEE:s långsiktiga resiliens och dess metoder
E. coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) är nu inne på sitt fjärde decennium. För ett mikrobiellt evolutionsexperiment av vilken varaktighet som helst är det viktigt att upprätthålla en reproducerbar miljö, undvika kontaminering, arkivera prover och noggrant mäta kondition. LTEE demonstrerar flera beprövade strategier för att uppnå dessa mål, inklusive användning av välskakade kolvar som skapar en homogen miljö och ett kemiskt definierat tillväxtmedium som stöder en låg celldensitet. Dessutom använder LTEE förfaderstammar som skiljer sig åt i en genetisk markör som ger en fenotyp (kolonifärg) som är både lätt att screena och selektivt neutral i evolutionsmiljön. Denna experimentella designfunktion ger ett sätt att identifiera intern och extern kontaminering och underlättar mätning av kondition. Alla förfaranden och skyddsåtgärder som har använts av LTEE sedan 1988 har dock inte visat sig vara lika robusta. Vissa metoder som var tillförlitliga när LTEE började har blivit mindre effektiva eftersom E. coli-populationerna har utvecklats. Lyckligtvis kan dessa problematiska metoder nu utökas eller ersättas med hjälp av teknik som utvecklats sedan experimentets början.

Upptäcka kontaminering
Detektion av kontaminering är avgörande för LTEE. Kontaminering kan vara av två slag: mellan LTEE-populationer (korskontaminering) och med mikrober från miljön (yttre kontaminering). För det mesta förhindrar noggrann användning av aseptiska tekniker och noggrann uppmärksamhet under medieberedning och de dagliga överföringarna båda typerna av kontaminering, men de händer. Tidigt i experimentet kunde plätering på TA-agar användas för att upptäcka fall av korskontaminering eftersom överföringar alltid har växlat mellan Ara− och Ara+ populationer. Fingeravtrycket av känslighet och resistens hos dessa E. coli mot vissa bakteriofager var också avsett att vara en designfunktion som kunde skilja LTEE-populationerna från vanliga E. coli-laboratoriestammar som kan förorena dem4. Dessa genetiska markörer har dock blivit opålitliga när experimentet har utvecklats (t.ex. vissa populationer bildar inte längre kolonier på TA-agar)10,35. Lyckligtvis har populationerna genetiskt divergerat eftersom de har upplevt separata evolutionära historier under experimentet, vilket har skapat nya genetiska markörer som nu kan användas för att upptäcka korskontaminering. Till exempel har varje population utvecklat en unik kombination av mutationer i pykF- och nadR-generna 14,36,37. Vi PCR PCR amplifierar och sekvenserar ibland dessa två gener för att testa om kolonier med ovanliga morfologier eller färger beror på korskontaminering. Eftersom kostnaderna för helgenom- och helpopulationssekvensering fortsätter att sjunka kan rutinmässig sekvensering av LTEE-populationerna snart bli möjlig, vilket ger nya möjligheter att övervaka dem för tecken på kontaminering.

Mätning av tävlingskondition
Ett annat fall där LTEE har vuxit ur sina ursprungliga metoder är att konditionen hos den utvecklade E. coli har ökat i experimentmiljön i en sådan grad att man inte längre direkt kan mäta konditionen hos dagens populationer i förhållande till deras förfäder med hjälp av det protokoll som beskrivs här. De utvecklade befolkningarna konkurrerar ut förfäderna i en sådan utsträckning att få eller inga förfäderskolonier återstår att räkna efter en endagstävling. Ett tillvägagångssätt för att hantera denna stora konditionsskillnad är att använda ojämna startförhållanden för stammarna och vikta de initiala volymerna som blandas mot den mindre passande konkurrenten (t.ex. 90 μL förfader och 10 μL utvecklad konkurrent). Ett andra tillvägagångssätt är att identifiera en utvecklad Ara−-klon som har en högre kondition än LTEE-förfadern, isolera en spontan Ara+-återmutant av den genom selektion på MA-agar och sedan verifiera att den återställande stammen har samma kondition som sin förälder med hjälp av en tävlingsanalys 6,38. Detta nya Ara−/Ara+-par kan sedan användas som en uppsättning gemensamma konkurrerande stammar i stället för REL606/REL607. Idealt sett kommer den utvecklade Ara−-klonen som valts som en gemensam konkurrent (och dess Ara+-återvändare) att ha mellanliggande kondition i förhållande till alla stammar av intresse för ett experiment. Under de första 50 000 generationerna av LTEE gav dessa två tillvägagångssätt (med olika startförhållanden eller en gemensam konkurrent) inte meningsfullt olika konditionsmätningar jämfört med den typiska metoden39.

Dessa ändringar av konkurrensprotokollet gör vissa förenklade antaganden som kanske inte alltid är sanna. En är att konditionsmätningar är transitiva. Det vill säga, om vi konkurrerar två populationer vardera mot en gemensam konkurrentstam separat, kan vi härleda den relativa konditionen hos de två populationerna till varandra. Detta förhållande har visat sig vara sant för LTEE40, för det mesta, men det är inte för andra experiment41. En orsak till denna diskrepans kan vara utvecklingen av negativa frekvensberoende fitnesseffekter. Denna situation uppstår när stammar isolerade från två olika divergerade linjer från population A−2 i LTEE tävlas mot varandra19,42. Var och en har en fördel när den är sällsynt på grund av korsmatning, vilket stabiliserar deras samexistens. Sekvenseringsdata som visar långsiktig samexistens av släktlinjer med olika uppsättningar mutationer tyder på att liknande interaktioner också kan ha uppstått i andra LTEE-populationer14,43, även om det inte är klart om de är tillräckligt starka för att märkbart ändra konditionsuppskattningar. Slutligen innebär utvecklingen av aerob tillväxt på citrat i population A-3 i LTEE32 att dessa cellers kondition nu innefattar användningen av en "privat" resurs när de konkurreras mot celler som inte kan använda citrat, vilket komplicerar tolkningen av dessa resultat. Trots dessa undantag har användningen av en låg glukoskoncentration och välskakad miljö utan tvekan förenklat att göra fitnessjämförelser mellan LTEE-stammar och populationer.

Vid senare generationer bildar några av LTEE-populationerna inte längre kolonier på TA-agar, vilket gör det svårt eller omöjligt att utföra tävlingsexperiment med även modifierade protokoll10. Alternativa metoder som inte kräver kolonitillväxt kan potentiellt användas för att bestämma den relativa representationen av två konkurrenter, såsom FREQ-seq som använder nästa generations sekvensering för att räkna andelen läsningar som innehåller två alternativa alleler i en amplikon44. Denna metod eller liknande kan potentiellt användas med Ara-allelerna eller med nyutvecklade mutationer, såsom de i pykF och nadR, kontra förfädernas sekvens. Att utföra genetiska modifieringar som introducerar andra typer av neutrala markörer kan också användas för att mäta relativ kondition. Till exempel har fluorescerande proteingener införts i kromosomerna hos celler i LTEE-utlöparexperiment så att konkurrenter kan räknas med hjälp av flödescytometri45. Ett annat tillvägagångssätt, som öppnar möjligheten att blanda ihop mer än två stammar i samma tävlingskolv, är att infoga streckkoder som kan PCR-amplifieras och sekvenseras i genomerna hos olika konkurrenter. Detta tillvägagångssätt har använts för härstamningsspårning i evolutionsexperiment46. Både flödescytometri och streckkodssekvensering kan noggrant mäta mycket mer extrema förhållanden mellan två stammar kontra koloniräkning (eftersom de kan fråga > 10 000 celler / genom jämfört med de < 500 som kan räknas på en agarplatta), så att använda dessa metoder lovar också att öka det dynamiska området när det gäller fitnessskillnader som kan mätas i förhållande till en gemensam konkurrent.

Alternativa konstruktioner för långsiktiga mikrobiella evolutionsexperiment
Trots alla sina dygder är LTEE inte perfekt. Vissa aspekter av dess design gör det arbetsintensivt och mottagligt för mänskliga fel. Till exempel måste en forskare varje dag komma in i labbet och pipetten mellan Erlenmeyer-kolvar för att fortsätta experimentet. Tävlingsexperiment kan också utgöra skrämmande logistiska hinder, med tanke på att kraven på sterila glasvaror, media, inkubatorutrymme och koloniräkning snabbt eskalerar när även ett litet antal konkurrenter testas med blygsam replikering. Vi får ofta frågan varför vi inte utnyttjar laboratorieautomationssystem, såsom pipetterande robotar som arbetar på 96-brunns mikroplattor, eller kontinuerliga odlingssystem, såsom kemostater eller turbidostater. Svaret är enkelt: LTEE är på sätt och vis en fånge i sin egen långa historia. Vi vågar inte avvika från 10 ml kulturer som skakar med en viss hastighet i 50 ml Erlenmeyer-kolvar eftersom detta skulle riskera att förändra experimentet i grunden. Subtila aspekter av miljön som dessa populationer har anpassat sig till i årtionden (t.ex. mängden luftning) skulle förändras i mikroplattor eller kontinuerliga odlingssystem. Befolkningsflaskhalsen vid varje överföring kan också vara annorlunda (mindre i mikroplattor, till exempel), vilket förändrar den evolutionära dynamiken. Kort sagt, att avvika från de metoder som beskrivs här skulle göra LTEE till ett annat experiment, eller åtminstone riskera att införa en diskontinuitet som skulle störa evolutionära banor.

Forskare som utformar nya evolutionsexperiment bör överväga dessa andra sätt att föröka mikrobiella populationer, samtidigt som de är medvetna om deras potentiella fördelar och nackdelar. Att använda pipetterrobotar för att överföra populationer i mikrobrunnsplattor är logistiskt enklare på vissa sätt och kan visa sig vara ganska kraftfullt på grund av det stora antalet replikatpopulationer som kan förökas på detta sätt47,48,49. Automatiserade överföringar i de flesta nuvarande inställningar sker dock inte under helt sterila förhållanden, vilket ökar sannolikheten för kontaminering utifrån. För att förhindra kontaminering kompletteras tillväxtmediet ofta med antibiotika, som blir en egenskap hos miljön som påverkar evolutionen. Överföringar i mikrobrunnsplattor är också mer benägna att korskontaminera händelser. Slutligen tenderar miljön hos mikrobrunnsplattor - särskilt om de inte skakas - att välja för väggtillväxt, aggregering och andra fenomen som kan komplicera evolutionen genom att skapa flera nischer i en brunn. Att använda rika medier eller höga koncentrationer av näringsämnen för att hålla befolkningsstorlekarna stora i små brunnar kommer sannolikt att förvärra dessa komplexiteter. Om sådana interaktioner uppstår kan de göra mätning och tolkning av kondition mycket svårare.

Kontinuerliga odlingssystem för mikrobiell evolution inkluderar kemostater, där färskt medium ständigt pumpas in och kultur pumpas ut, och turbidostater, i vilka kulturer periodiskt späds ut genom automatiserad avkänning och pumpning för att upprätthålla celler i ett tillstånd av konstant tillväxt. Dessa system är mycket användbara när man vill modellera mikrobiell fysiologi och evolution eftersom de undviker att mikrober övergår mellan tillväxt och svält genom att hålla dem i en miljö som alltid har näringsämnen50. Man kan till och med lägga till sensorer som gör realtidsmätningar av optisk densitet, O2-förbrukning, pH och andra aspekter av en kulturs miljö och tillväxt. Men nuvarande kontinuerliga kultursystem kräver antingen dyra inköp av utrustning eller specialkunskaper för att bygga anpassade inställningar51,52,53,54. Även väggtillväxt, där celler undgår utspädning genom att fästa vid odlingskammaren, försvårar evolutionär dynamik i kontinuerliga odlingssystem om de inte periodiskt steriliseras. På grund av dessa begränsningar har de flesta chemostat- och turbidostatutvecklingsexperimenten hittills varit av begränsad varaktighet och / eller involverat relativt få oberoende utvecklande populationer jämfört med seriella överföringsutvecklingsexperiment.

Slutsats
De metoder vi demonstrerar här för LTEE är avgörande för att studera dess unika historiska rekord och fortsätta den öppna utvecklingen av dessa E. coli-populationer. De ger också en utgångspunkt för andra som överväger nya evolutionsexperiment som kan dra nytta av laboratorieautomatisering eller lägga tillbaka olika element av komplexiteten som finns i naturliga miljöer som avsiktligt utelämnades från LTEE. Sedan 1988 har experimentell evolution blomstrat som ett fält. Under denna tid har forskare i laboratorier över hela världen visat den enorma flexibiliteten i detta tillvägagångssätt för att studera evolution, förnya genom att införa kreativa experimentella mönster och övervaka resultaten med hjälp av ny teknik. LTEE:s metoder utgör ingen slutpunkt, men vi hoppas att de kommer att fortsätta inspirera och utgöra en grund för fältet långt in i framtiden.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklarerade.

Acknowledgments

Vi tackar Richard Lenski och de många forskare som har studerat och bidragit till att upprätthålla Long-Term Evolution Experiment med E. coli, inklusive särskilt Neerja Hajela. LTEE stöds för närvarande av National Science Foundation (DEB-1951307).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma-Aldrich T8877
20 mL Glass Beaker Sigma-Aldrich CLS100020
50 mL Erlenmeyer Flasks Sigma-Aldrich CLS498050
Agar Sigma-Aldrich A1296
Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich AX1385
Antifoam Sigma-Aldrich A5757
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
Freezer Box (2") VWR 82007-142
Freezer Box (3") VWR 82007-144
Freezer Box Cell Divider (49-place) VWR 82007-150
Freezer Box Cell Divider (81-place) VWR 82007-154
Freezer Vials (1/2-Dram) VWR  66009-816 
Freezer Vials (2-Dram) VWR  66010-560 
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Glycerol Fisher Scientific G33
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Metal Tray Winco SPJP-202
Petri Dish Fisher Scientific FB0875712
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate Sigma-Aldrich P5504
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P5379
Sodium Chloride Sigma-Aldrich M7506
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate Sigma-Aldrich C7254
Test Tube Cap (18mm) VWR 10200-142
Test Tube Rack (18mm, steel) Adamas-Beta N/A Test Tube Racks Stainless Steel Grid Arrangement 72 Holes (17-19 mm)
Test Tubes (18 x 150 mm) VWR 47729-583
Thiamine, Hydrochloride Millipore 5871
Tryptone Gibco 211705
Yeast Extract Gibco 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
  2. Fox, J. W., Lenski, R. E. From here to eternity-the theory and practice of a really long experiment. PLoS Biology. 13 (6), e1002185 (2015).
  3. Daegelen, P., Studier, F. W., Lenski, R. E., Cure, S., Kim, J. F. Tracing ancestors and relatives of Escherichia coli B, and the derivation of B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 634-643 (2009).
  4. Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12 genomes. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 653-680 (2009).
  5. Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
  6. Lenski, R. E. Experimental studies of pleiotropy and epistasis in Escherichia coli. II. Compensation for maladaptive pleiotropic effects associated with resistance to virus T4. Evolution. 42 (3), 425-432 (1988).
  7. Calcott, P. H., Gargett, A. M. Mutagenicity of freezing and thawing. FEMS Microbiology Letters. 10 (2), 151-155 (1981).
  8. Lenski, R. E., Travisano, M. Dynamics of adaptation and diversification: a 10,000-generation experiment with bacterial populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (15), 6808-6814 (1994).
  9. Wiser, M. J., Ribeck, N., Lenski, R. E. Long-term dynamics of adaptation in asexual populations. Science. 342 (6164), New York, N.Y. 1364-1367 (2013).
  10. Lenski, R. E., et al. Sustained fitness gains and variability in fitness trajectories in the long-term evolution experiment with Escherichia coli. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1821), 20152292 (2015).
  11. Barrick, J. E., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  12. Blount, Z. D., Barrick, J. E., Davidson, C. J., Lenski, R. E. Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population. Nature. 489 (7417), 513-518 (2012).
  13. Tenaillon, O., et al. Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment. Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).
  14. Good, B. H., McDonald, M. J., Barrick, J. E., Lenski, R. E., Desai, M. M. The dynamics of molecular evolution over 60,000 generations. Nature. 551 (7678), 45-50 (2017).
  15. Consuegra, J., et al. Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria. Nature Communications. 12 (1), 980-980 (2021).
  16. Cooper, T. F., Rozen, D. E., Lenski, R. E. Parallel changes in gene expression after 20,000 generations of evolution in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (3), 1072-1077 (2003).
  17. Favate, J. S., Liang, S., Cope, A. L., Yadavalli, S. S., Shah, P. The landscape of transcriptional and translational changes over 22 years of bacterial adaptation. eLife. 11, e81979 (2022).
  18. Khan, A. I., Dinh, D. M., Schneider, D., Lenski, R. E., Cooper, T. F. Negative epistasis between beneficial mutations in an evolving bacterial population. Science. 332 (6034), 1193-1196 (2011).
  19. Plucain, J., et al. Epistasis and allele specificity in the emergence of a stable polymorphism in Escherichia coli. Science. 343 (6177), 1366-1369 (2014).
  20. Quandt, E. M., Deatherage, D. E., Ellington, A. D., Georgiou, G., Barrick, J. E. Recursive genomewide recombination and sequencing reveals a key refinement step in the evolution of a metabolic innovation in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2217-2222 (2014).
  21. Leon, D., D'Alton, S., Quandt, E. M., Barrick, J. E. Innovation in an E. coli evolution experiment is contingent on maintaining adaptive potential until competition subsides. PLoS Genetics. 14 (4), e1007348 (2018).
  22. Bennett, A. F., Lenski, R. E., Mittler, J. E. Evolutionary adaptation to temperature. I. Fitness responses of Escherichia coli to changes in its thermal environment. Evolution. 46 (1), 16-30 (1992).
  23. Kibota, T. T., Lynch, M. Estimate of the genomic mutation rate deleterious to overall fitness in E. coli. Nature. 381 (6584), 694-696 (1996).
  24. Friesen, M. L., Saxer, G., Travisano, M., Doebeli, M. Experimental evidence for sympatric ecological diversification due to frequency-dependent competition in Escherichia coli. Evolution. 58 (2), 245-260 (2004).
  25. Cooper, T. F. Recombination speeds adaptation by reducing competition between beneficial mutations in populations of Escherichia coli. PLoS Biology. 5 (9), e225 (2007).
  26. Cooper, T. F., Lenski, R. E. Experimental evolution with E. coli in diverse resource environments. I. Fluctuating environments promote divergence of replicate populations. BMC Evolutionary Biology. 10, 11 (2010).
  27. Quan, S., et al. Adaptive evolution of the lactose utilization network in experimentally evolved populations of Escherichia coli. PLoS Genetics. 8 (1), e1002444 (2012).
  28. Deatherage, D. E., Kepner, J. L., Bennett, A. F., Lenski, R. E., Barrick, J. E. Specificity of genome evolution in experimental populations of Escherichia coli evolved at different temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), E1904-E1912 (2017).
  29. Izutsu, M., Lake, D. M., Matson, Z. W. D., Dodson, J. P., Lenski, R. E. Effects of periodic bottlenecks on the dynamics of adaptive evolution in microbial populations. BioRixv. , 4457 (2021).
  30. Chavarria-Palma, J. E., Blount, Z. D., Barrick, J. E. LTEE Media Recipes. , (2022).
  31. Barrick, J. E., Lake, D. M. fitnessR: fitnessR-v1.0.0. barricklab. , (2023).
  32. Blount, Z. D., Borland, C. Z., Lenski, R. E. Historical contingency and the evolution of a key innovation in an experimental population of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (23), 7899-7906 (2008).
  33. Grant, N. A., Magid, A. A., Franklin, J., Dufour, Y., Lenski, R. E. Changes in cell size and shape during 50,000 generations of experimental evolution with Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 203 (10), 22 (2021).
  34. Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
  35. Meyer, J. R., et al. Parallel changes in host resistance to viral infection during 45,000 generations of relaxed selection. Evolution. 64 (10), 3024-3034 (2010).
  36. Woods, R., Schneider, D., Winkworth, C. L., Riley, M. A., Lenski, R. E. Tests of parallel molecular evolution in a long-term experiment with Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (24), 9107-9712 (2006).
  37. Barrick, J. E., Deatherage, D. E., D'Alton, S. LTEE-Ecoli: genomics resources for the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. , Available from: https://github.com/barricklab/LTEE-Ecoli (2022).
  38. Izutsu, M., Lenski, R. E. Experimental test of the contributions of initial variation and new mutations to adaptive evolution in a novel environment. Frontiers in Ecology and Evolution. 10, 958406 (2022).
  39. Wiser, M. J., Lenski, R. E. A comparison of methods to measure fitness in Escherichia coli. PLoS One. 10 (5), 0126210 (2015).
  40. de Visser, J. A. G. M., Lenski, R. E. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. XI. Rejection of non-transitive interactions as cause of declining rate of adaptation. BMC Evolutionary Biology. 2 (1), 19 (2002).
  41. Paquin, C. E., Adams, J. Relative fitness can decrease in evolving asexual populations of S. cerevisiae. Nature. 306 (5941), 368-371 (1983).
  42. Rozen, D. E., Lenski, R. E. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. VIII. Dynamics of a balanced polymorphism. The American Naturalist. 155 (1), 24-35 (2000).
  43. Quandt, E. M., Gollihar, J., Blount, Z. D., Ellington, A. D., Georgiou, G., Barrick, J. E. Fine-tuning citrate synthase flux potentiates and refines metabolic innovation in the Lenski evolution experiment. eLife. 4, e09696 (2015).
  44. Chubiz, L. M., Lee, M. -C., Delaney, N. F., Marx, C. J. FREQ-Seq: a rapid, cost-effective, sequencing-based method to determine allele frequencies directly from mixed populations. PLoS One. 7 (10), e47959 (2012).
  45. Gallet, R., Cooper, T. F., Elena, S. F., Lenormand, T. Measuring selection coefficients below 10-3: method, questions, and prospects. Genetics. 190 (1), 175-186 (2012).
  46. Levy, S. F., et al. Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking. Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).
  47. Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
  48. Frenkel, E. M., et al. Crowded growth leads to the spontaneous evolution of semistable coexistence in laboratory yeast populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (36), 11306-11311 (2015).
  49. Jordt, H., et al. Coevolution of host-plasmid pairs facilitates the emergence of novel multidrug resistance. Nature Ecology and Evolution. 4 (6), 863-869 (2020).
  50. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  51. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and use of multiplexed chemostat arrays). Journal of Visualized Experiments. (72), e50262 (2013).
  52. Toprak, E., et al. Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).
  53. Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).
  54. Ekkers, D. M., Branco Dos Santos, F., Mallon, C. A., Bruggeman, F., Van Doorn, G. S. The omnistat: A flexible continuous-culture system for prolonged experimental evolution. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 932-942 (2020).

Tags

Genetik utgåva 198
Dagliga överföringar, arkivering av populationer och mätning av kondition i det långsiktiga evolutionsexperimentet med <em>Escherichia coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barrick, J. E., Blount, Z. D., Lake, … More

Barrick, J. E., Blount, Z. D., Lake, D. M., Dwenger, J. H., Chavarria-Palma, J. E., Izutsu, M., Wiser, M. J. Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. J. Vis. Exp. (198), e65342, doi:10.3791/65342 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter