Summary
Ex vivo ライブイメージングは、生体組織における細胞の動きや相互作用のダイナミックなプロセスを研究するための強力な技術です。ここでは、培養された成体マウス切歯全体の歯上皮細胞をライブトラッキングするために2光子顕微鏡法を実装するプロトコルを紹介します。
Abstract
成長を続けるマウス切歯は、成体上皮幹細胞や間葉系幹細胞の調節や歯の再生を研究するための扱いやすいモデル系として注目されています。これらの前駆細胞集団は、組織の恒常性を維持し、失われた細胞を応答的に再生するために、活発に分裂、移動、分化します。しかし、固定された組織切片を用いた従来の解析では、細胞の動きや相互作用のダイナミックなプロセスを捉えることができず、その制御を研究する能力が制限されていました。この論文では、外植片培養システムでマウス切歯全体を維持し、多光子タイムラプス顕微鏡を使用して歯上皮細胞をライブトラックするプロトコルについて説明します。この技術は、歯科研究のための既存のツールボックスに追加され、研究者が生体組織内の細胞の挙動と組織に関する時空間情報を取得することを可能にします。この方法論は、研究者が歯の再生と再生の両方で起こる動的な細胞プロセスを制御するメカニズムをさらに探求するのに役立つと期待しています。
Introduction
過去20年間で、マウス切歯は成体幹細胞の調節と歯の再生の原理を研究するための非常に貴重なプラットフォームとして浮上してきました1,2。マウス切歯は継続的に成長し、動物の生涯を通じて再生します。これは、上皮幹細胞と間葉系幹細胞の両方を維持することによって行われ、自己複製して歯のさまざまな細胞型に分化することができます1,2。歯の上皮幹細胞はエナメル質マトリックスを分泌する髄芽細胞を生じさせるのに対し、歯の間葉系幹細胞は歯芽細胞、セメント芽細胞、線維芽細胞を生じさせ、それぞれ象牙質、セメント質、歯根膜を形成します3,4,5,6。この新しい細胞の絶え間ない供給は、組織の恒常性を維持し、咀嚼の摩耗や損傷のために失われた古い細胞の交換を可能にします7,8。したがって、歯科幹細胞の維持と分化を調節する細胞および分子メカニズムの解明は、関心が高まっている分野である歯の再生を理解する上で中心的な役割を果たします。
解剖学的には、成体マウス切歯の大部分は顎骨に包まれています。歯の切歯縁が露出している間、切歯の頂端はソケット内に収まり、歯根膜と結合組織を介して周囲の骨にしっかりと取り付けられています(図1A、B)。切歯の頂端は歯の成長領域でもあり、上皮層と間葉系歯髄の両方で歯の幹細胞と前駆細胞を維持しています9,10,11,12,13。具体的には、歯の上皮幹細胞は、頂端芽として知られる上皮の球状端(唇頸管ループとも呼ばれる)に維持されています(図1C)。腸上皮や表皮と同様に、切歯の上皮再生は、主に活発に循環する幹細胞と、頸管ループの内側に存在する移行増幅細胞14、15、16、17と呼ばれるその高度に増殖する中間子孫によって支えられています。しかし、切歯上皮が再生中に静止幹細胞を含み、利用するかどうかは、まだ決定されていない。対照的に、根尖歯髄では活性型と静止期の歯間葉系幹細胞の両方が同定されており、静止幹細胞は損傷修復中に活性化される予備集団として機能する13,18。
マウス切歯の再生と再生の生物学に関する発見の多くは、組織学的調査の結果であり、サンプルは明確な時間的分岐点で採取され、固定され、処理され、特定の平面に沿ってミクロン単位の薄切りに切断されます。系統追跡や遺伝的摂動を可能にするさまざまなマウスモデルの組織学的切片の詳細な分析を通じて、科学者たちは、さまざまな前駆細胞集団の細胞系統、ならびに切歯の恒常性と損傷の修復を制御する遺伝的およびシグナル伝達経路を特定しました19,20,21.しかし、切片内の非生命細胞の静的な2次元(2D)画像では、細胞の形状変化、動き、細胞動態など、生体組織における細胞の挙動や空間的組織の全範囲を捉えることはできません。組織切片では解決できない時間スケールで発生するこれらの急速な細胞変化を検出および測定するには、別の戦略が必要です。さらに、このような情報を取得することは、歯の細胞がどのように相互作用し、さまざまなシグナル刺激に反応し、組織の構造と機能を維持するために自己組織化するかを理解する上でも重要です。
2光子顕微鏡を用いた4次元(4D)深部組織イメージングの出現22は、3つの空間次元と時間分解能を統合した技術であり、培養組織の外植片、オルガノイド、さらには組織をその場で時空間的に検査することを可能にし、組織学的分析の固有の限界を克服しました23,24,25,26 .例えば、発生中の歯上皮の4Dライブイメージングは、組織の成長、シグナル伝達中心の形成、および歯の上皮形態形成を調整する細胞分裂と移動の時空間パターンを明らかにしました27,28,29,30,31,32.成体マウス切歯では、最近、4Dイメージングが、歯の上皮損傷修復中の細胞挙動を研究するために適応されています。ライブイメージングにより、基底層の層中間細胞が基底層の髄芽細胞に直接変換され、損傷した上皮を再生できることが明らかになり、上皮損傷修復の従来のパラダイムに挑戦します15。
ここでは、口唇頸管ループの上皮細胞に着目して、成体マウス切歯の解剖、培養、イメージングについて述べる(図1)。この技術により、歯細胞の活力を12時間以上維持し、蛍光標識された細胞を単一細胞の分解能でライブトラッキングすることができます。このアプローチにより、通常の培養条件下、または遺伝的、物理的、化学的摂動に対する応答における細胞の動きと移動、および細胞の形状と分裂配向の動的な変化を調べることができます。
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Protocol
すべてのマウスは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)またはエルサレムヘブライ大学(HUJI)の病原体のない動物施設で飼育されました。マウスを用いたすべての実験は、それぞれの動物管理委員会(IACUC)によって承認された規制およびプロトコルに従って実施されました(ARC-2019-013;UCLA)または(MD-23-17184-3;HUJI)です。実験ステップの一般的なワークフローを 図2Aに示します。このプロトコルで使用されるすべての機器、試薬、および材料に関連する詳細については、 材料表 を参照してください。
1. 溶液およびゲルの調製
- 解剖培地:0.5%グルコースで新鮮なDMEM/F12を調製し、ステップ2.4で必要になるまで37°Cで保温します。
注:フェノールレッドを含まないDMEM/F12を使用して、ライブイメージング中の自家蛍光を低減します。 - 培地 1x:50% DMEM/F12、ラット血清 50%、グルタミン代替物 1x 、MEM 非必須アミノ酸 1x MEM、グルコース 1%、L-アスコルビン酸 0.1 mg/mL L-アスコルビン酸、ペニシリン-ストレプトマイシン 0.5% を使用して、新鮮な培地を調製します。ステップ5.5で必要になるまで、37°Cで保温します。この培地は、ライブイメージング中の切歯外植片の培養に使用されます。
注:ラット血清は高品質で、研究者または市販の供給源から組織全体を培養するために特別に調製されている必要があります。特に、血液凝固が形成される前に、血液を遠心分離(室温で1,200 × g で5分間)する必要があります。遠心分離後、得られたフィブリン血栓は圧搾して廃棄すべきである33。 - 培養ゲル:ゲルの目的は、イメージング中にサンプルを固定化することであり、新鮮に調製されます。
- 200 mgの低融点アガロースを10 mLのDMEM/F12にマイクロ波で溶解し、DMEM/F12で2%ゲルを作製します。2%ゲルを37°Cに保ちます。
- 50%ラット血清、1xグルタミン代替品、1x MEM非必須アミノ酸、1%グルコース、0.1 mg/mL L-アスコルビン酸、および0.5%ペニシリン-ストレプトマイシンを混合して、2x培地(DMEM/F12なし)を作成します。2倍培地(DMEM/F12なし)を37°Cに温めます。
- 等量の2%ゲルと2倍培地(DMEM/F12なし)を混合して、1%培養ゲルを作製します。ステップ5.1で必要になるまで、1%培養ゲルを37°Cに保ちます。
注意: ゲル化を防ぐために、混合する前にすべての溶液が温かいことを確認してください。1%ゲルは成体マウス切歯の培養に適していることがわかりました。ゲル化率は、他の組織を培養する場合は経験的に決定する必要があります。
2. 成体マウス下顎骨の摘出
- IACUCによって承認された標準的な手順を使用して、希望の年齢でマウスを安楽死させます。
注:ここでは、CO2窒息とそれに続く子宮頸部脱臼を使用します。動物の安楽死に関する規制は、地域によって異なる場合があります。研究者は、実験を行う前に必要な機関の承認を取得し、地域の動物管理規制を確実に遵守する必要があります。 - 70%エタノールを使用してマウスを消毒します。
- マウスの首を切り落とし、左右の下顎骨を摘出します。
- マウスをお腹の上に置き、#9シングルエッジの工業用カミソリの刃を使用して首の部分を切り取り、マウスの頭を体の他の部分から分離します。
注:咽頭または頸部の組織も採取する場合は、斬首を行わず、直接ステップ2.3.2に進むことができます。 - マウスを裏返して、腹側が上を向き、下顎骨に簡単にアクセスできるようにします。
- 親指と人差し指で動物の頭をそっと挟んで固定します。
- カミソリの刃を使って、下唇から襟ぐりに向かって下顎の皮膚を切る矢状中部切開を行います。
注:#15サージカルブレードを使用して、切開とその後の解剖を行うこともできます(ステップ2.3.6-2.3.9)。 - 切開したら、親指と人差し指を使って切った皮膚を広げ、その下の筋肉と顎骨を露出させます。
- カミソリの刃を使って下顎の頬側の咬筋を切断し、左右の半顎骨の外側に筋肉の付着がなくなるようにします。
- 下顎骨の内側に沿って筋舌骨筋を切断し、そこにある筋肉の付着を取り除きます。
- 2つの半顎骨をつなぐ下顎結合をもう一度切開します。切断されると、下顎骨は左右半分に分離されます。
- 下顎顆と側頭下顎関節の間にかみそりの刃をくさびで留め、頭の残りの部分から半身骨を慎重に解剖します。
注:切断中に切歯を同時にそっと引っ張ると便利であることがわかりました。下顎骨を骨折したり、内部の軟部組織を傷つけたりしないように注意する必要があります。
- マウスをお腹の上に置き、#9シングルエッジの工業用カミソリの刃を使用して首の部分を切り取り、マウスの頭を体の他の部分から分離します。
- 解剖した下顎骨を予熱した解剖培地ですぐにペトリ皿に移し(ステップ1.1)、#15サージカルブレードを使用して残りの筋肉組織を取り除きます。
注:サンプルを低温培地に保管すると、細胞活性が低下し、ライブイメージング中に増殖や細胞移動などの特定の細胞活性の回収が遅れたり、失敗したりします。
3. マウス切歯全体の単離
注:切歯のさらなる分離は、明視野解剖顕微鏡で行われます。
- 切歯ソケットを覆い、切歯の頂端部分を収容する下顎骨の楕円形の領域を視覚的に識別します。
- 下顎骨の内側(舌側)が上を向くように下顎骨を配置します。
- 鋸歯状の鉗子で下顎骨を所定の位置に保持しながら、#15外科用ブレードを使用して、顆から大臼歯に向かっている方向に上にある膜骨を削り取ることにより、楕円形領域に窓を生成します。これにより、内面の頂端切歯の軟部組織が露出します。
- 下顎骨をひっくり返して、外側(頬側)の表面が上を向くようにします。
- ステップ3.3で説明したように、下顎骨の外側の楕円形の領域に窓を生成し、メスの先端を使用して、端に残っている骨片を取り除きます。歯の先端が両側から見えることを確認してください。
注意: 下にある軟部組織の損傷を防ぐために、骨を剃るときは過度の圧力を避けてください。 - 切歯の周りの骨を体系的に切り取り、歯全体を分離します。
- 最初に顆状突起を取り除くために、頂端切歯のすぐ隣にある平面できれいに切り込みを入れます。
注意: 切歯に切り込まないように注意してください。 - 第3大臼歯のすぐ後ろに2回目の切り込みを入れますが、歯を傷つけずに切歯の背側に切り込みを入れます。これにより、コロノイド突起を含む骨が除去されます。
- 角突起の先端から切歯に向かって連続的に切断し、腹側下顎骨を段階的に徐々に除去します。
注:歯の上皮と関連する歯周組織は、腹側骨の大部分を一度に切断すると、骨に付着していることが多く、簡単に剥がれてしまいます。切歯の軟部組織から骨を分離するには、切歯の頂端にある2つの組織の間にメス(または一対の鋭い鋸歯状でない鉗子)を挿入し、器具を繊細に前方にスライドさせます。 - 大臼歯で歯槽骨と切歯に付着したままの残りの骨を切り取ります。
- 切歯全体が分離されました。完全に切除した切歯を清潔な温かい解剖培地を入れた皿に移します(ステップ1.1)。
- 最初に顆状突起を取り除くために、頂端切歯のすぐ隣にある平面できれいに切り込みを入れます。
- 手順3.2〜3.6を繰り返して、必要に応じて追加の切歯を分離します。
注:マウスの上顎/上切歯も成体幹細胞を維持しており、歯の再生を研究するために使用できます34。歯科研究者は通常、上切歯よりもアクセスしやすく、解剖しやすい下切歯に焦点を当てます。下顎切歯前駆細胞と上顎切歯前駆細胞の違いは、まだ決定されていません。
4.切歯上皮子宮頸部ループを露出させるための歯周組織の除去
- 切歯全体を舌側に横たえ、鋸歯状の鉗子で歯を所定の位置に保持しながら、#5の細い鉗子を使用して、頂端切歯と子宮頸部ループ領域を覆う歯周組織を押し込みます。
- 歯周組織を頂端芽から慎重に剥がし、子宮頸管ループの外側(または他の関心領域)がスコープの下に見えるようにします。
注意: 歯の上皮を傷つけたり、間葉から剥離したりしないように注意する必要があります。切歯が関心領域に蛍光シグナルを有し、蛍光解剖顕微鏡が利用可能な場合、蛍光シグナルを使用して組織タイプを区別し、解剖を助けることができます。セクション2〜4を効率的に実施して、サンプルを培地に迅速に移し、外植片培養によって適切に維持できるようにすることが重要です(下記参照)。
5. 外植片培養のための組織包埋
- 500 μLの温かい未固化培養ゲルを24ウェルプレートのウェルに加え、解剖した切歯全体をウェルにすばやく移します。プレートを数回回転させて切歯をすすぎます。
- 400 μLの温かい未固化培養ゲルを培養皿に加え、すすぎ取った切歯を皿に移します。
注:灌流セットアップと互換性のある市販の培養皿を使用しています。代替オプションについては、手順 6.4 を参照してください。 - 切歯の向きを向けて、子宮頸部ループ領域(または他の関心領域)を皿の中心に配置し(図2A、B)、頂端切歯の傾きを目的のイメージング面に調整します。
注:組織の配向は、ゲル化が完了する前に迅速に行う必要があります。 - ゲルが固まったら、一対の細かい鉗子を使用して、関心領域の上にあるゲルを取り除き、ゲルで覆われないようにします。
- 十分な量の温かい培地を、サンプルを覆うように皿の端にゆっくりとピペッティングして添加します(~150 μL)。
- 外植片培養物を37°Cの細胞培養インキュベーターに移し、組織を沈降させ、培養条件に1時間調整します。
6. 切歯外植片のタイムラプス顕微鏡検査
注:この実験では、開口数1の25倍の水浸対物レンズを備えた正立顕微鏡を使用しました。一般に、深部組織イメージングには、高開口数の水浸レンズが最適です。
- 顕微鏡と2光子レーザーの電源を入れます。
- 培養皿をステージアダプターに固定し、灌流アダプターリングを上部に取り付けます(図2C)。
- ステージアダプターを温度コントローラーセットに接続して、培養を37°Cに維持します。
- アダプターリングの入口と出口をマイクロ灌流ポンプに接続し、ポンプの灌流速度を20に設定して培地の灌流を開始します。これにより、サンプルの上部に培地のゆっくりとした流れ(~5 mL/h)が生成されます(図2C)。
注:組織を安定的に制御された環境で維持するためのシステムの詳細については、 材料表 を参照してください。他のシステムも使用できます。37°Cの加熱プレートと、シリンジポンプに接続された入口と出口を備えた自家製の灌流培養皿(補足図S1)を組み合わせて使用することもできます。 - アダプターリングの上に大気制御バリアリング(ACBR)を置き、ACBRを通して対物レンズを下げて培地に接触させます(図2D)。
- レーザー波長を920 nmに調整して、GFPと赤色蛍光(tdTomatoなど)の両方の信号を可視化します。
- 接眼レンズを通してサンプルを見つけ、次に顕微鏡のソフトウェアでサンプルを見つけます。
- ソフトウェアを使用して、Zスタック、マルチポジションイメージング、および時間間隔を設定します。このプロトコルに従うには、4 μm の z ステップサイズと 5 分の時間間隔を 14 時間使用します。
注:5分を超える時間間隔では、スムーズな細胞の動きと分裂を捉えるには不十分であることが多いことがわかりました。 - タイムラプス撮影を開始します。
注意: サンプルの位置は最初の1時間でシフトする可能性があり、さらに調整が必要になる場合があります。 - ダウンストリームのデータ処理と分析のためにファイルを保存します。
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Representative Results
成体マウス切歯の頂端領域は下顎骨内に包まれているため(図1)、増殖領域内に存在する前駆細胞を可視化してライブトラッキングするために直接アクセスすることはできません。そこで、顎骨から切歯全体を抽出し、2光子タイムラプス顕微鏡用の外植片培養系で維持する方法を開発しました(図2)。ここでは、歯上皮の唇頸部ループ領域における細胞増殖と移動のダイナミックなプロセスを捉えた代表的な結果について説明します。
実験手順を実証するために、歯の上皮で緑色蛍光を発現する2つの異なるマウスモデルを使用しました。最初のマウスラインはK14Creです。R26rtTAです。ここで、K14Cre(MGI:2680713)は、ケラチン14プロモーター35からCreリコンビナーゼを発現し、R26rtTA対立遺伝子36(MGI:3584524)の上皮における逆テトラサイクリン制御トランスアクチベーターの発現を活性化する。ドキシサイクリンを投与すると、rtTAはtetO-H2B-GFP対立遺伝子37(MGI:3043783)からヒストンH2B-GFP発現を誘導し、上皮細胞核を緑色蛍光で標識します。これは、細胞の追跡や細胞分裂の検出に特に役立ちます。この実験では、H2B-GFP発現を活性化するために、生贄にする前にドキシサイクリン食を24時間動物に与えました。2番目のマウスラインはK14Creです。R26mT/mG、R26mT/mG(MGI:3803814)はCreレポーター38である。Cre活性がない場合、細胞は赤色蛍光を発する膜局在tdTomato(mT)を発現します。Cre媒介組換えにより、細胞は膜GFP(mG)を発現します。K14クレ;したがって、R26mT/mGは上皮細胞膜を緑色蛍光で標識し、非上皮細胞を赤色にします。これにより、細胞の形状、分裂、動きを簡単に視覚化できます。
まず、下顎骨を解剖し(図3A)、切歯の周囲の骨をすべて体系的に切除しました(図3B-G)。これにより、上皮に損傷を受けていない全切歯が得られました(図3H)。K14Creの緑色蛍光を検査することにより、歯上皮の無傷性を確認しました。R26rtTAです。tetO-H2B-GFPおよびK14Cre;R26mT/mGマウス(図4A、B、E、F)。この段階では、不透明な歯周組織がまだ頂端切歯を覆っているため、頸椎ループは光散乱のためにぼやけて見え、同様に下流のタイムラプスイメージングを妨げます(図4C、G)。そのため、歯周組織を慎重に除去し、各切歯で頸椎ループのある歯上皮が識別できるようにしました(図4D、H)。
次に、切歯を低融点アガロースに包埋し、 図2に示すように、2光子ライブイメージング用の灌流セットアップで培養しました。この演習では、歯上皮の頸椎ループ領域に着目し、14時間にわたって5分ごとに4μm間隔でzスタック画像を撮影しました(図5A)。特に、H2B-GFPシグナルは、活発な細胞分裂がある子宮頸部ループの通過増幅領域で主に観察されました(図5B)。これは、開放クロマチンでのH2B-GFP交換が高く、これらの活性細胞でのDNA複製後のヌクレオソームへの取り込みが多いためである可能性が高い39。
その後、ImageJを用いてタイムラプス画像を調べたところ、H2B-GFPシグナル40の分離に基づいて、イメージング期間を通じて多数の細胞分裂を観察することができました(補足ビデオS1および補足ビデオS2)。これは、外植片培養において組織が十分に維持され、細胞が活性であったことを示した。具体的には、有糸分裂細胞の中期プレートでの染色体の凝縮と整列を観察し、その後、後期に2つの娘細胞に分離する様子を観察することができました(図5C-N、ImageJプラグインTrackMateを使用して手動で追跡)。これらの分割の大部分は、基底膜に対して垂直または斜めの角度であった(図5C-Kおよび補足ビデオS1)。基底膜に平行な水平方向の分裂も検出できたが、発生頻度は低い(図5L-Nおよび補足ビデオS2)。歯上皮の細胞質分裂は、5〜10分以内に急速に起こることが多いことを指摘することが重要です。その結果、5分を超えるタイムラプス間隔では、これらの分割の一部を見逃す可能性があります。
細胞分裂イベントはK14Creでも明らかでした。R26mT/mG子宮頸管ループでは、すべての上皮細胞膜が緑色で標識されています(図6A)。有糸分裂細胞は、細胞の丸めと細胞質分裂によって同定でき(補足動画S3)、垂直および水平の両方の細胞分裂が観察可能であり(図6B-G)、H2B-GFPで得られた結果と同様でした。まとめると、これらの結果は、このプロトコルが、異なる細胞内構造を蛍光標識するマウス遺伝子モデルと組み合わせた場合に、切歯外植片の細胞挙動を調査するための強力なツールとして役立つことを示しています。
図1:マウスの顎と切歯の子宮頸管ループの概略図。 (A)切歯のかなりの部分が顎骨に埋め込まれています。成長領域は歯の頂端に位置し、その継続的な成長を支えています(濃い緑色の矢印)。(B)歯周組織に囲まれた頂端切歯の拡大。歯はエナメル質と象牙質で構成されており、それぞれ髄芽細胞と歯芽細胞によって形成される高度に石灰化した構造です。(C)歯の上皮前駆細胞と通過増幅細胞が唇頸部ループに存在し、より遠位上皮に髄芽細胞を生じさせることを示す頂端切歯の矢状切片(濃い緑色の破線矢印)。唇頸椎ループと比較して、舌側頸椎ループはサイズが小さく、通常は髄芽球を形成しません。歯の間葉系幹細胞は歯髄(紫色の領域)に存在し、歯芽細胞を生じさせます。略語:En =エナメル質;De =象牙質;Am =アメロ芽球;Od = 歯芽細胞;TAC = トランジット増幅細胞;laCL =唇頸椎ループ;liCL = 舌側頸椎ループ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ライブイメージングのためのマウス切歯外植片の維持。 (A)切歯の解剖から、ライブイメージング用の低融点アガロースへの組織の包埋まで、プロトコルの主要なステップを示す概略図。イメージング中に栄養素を一定に供給するために灌流セットアップが使用され、培養は37°Cに維持されます。 (B-D) ライブイメージング用の培養皿と灌流チャンバーの設定のステップバイステップのデモンストレーション。メディアの入口と出口は、それぞれピンクと黄色の矢印で示されています。略語: ACBR = Atmospheric Control Barrier Ring。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:マウス切歯全体の単離。(A)無傷の顎。(B-H)骨を徐々に取り除き、切歯全体を露出させました。BおよびCの赤い破線は、切歯ソケットの舌側と頬側を覆う膜骨を削り取った後の頂端切歯の露出した軟部組織を示しています(プロトコルのステップ3.3-3.5)。(D-G)青い矢印は、歯全体を分離するために除去された顆、大臼歯、および歯槽骨を表します(プロトコルのステップ3.6)。スケールバー = 2 mm (H)。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:ライブイメージングのための歯周組織の除去。(A-H)(A-D)K14Creからの代表的なサンプル。R26rtTAです。tetO-H2B-GFP、および(E-H)K14Cre;R26mT/mGマウスは、プロトコルのデモンストレーションに使用しました。解剖前は、歯上皮におけるGFPの発現が骨を通して見えた(A、E、黄色の矢印)。白い破線は、解剖されていない切歯の輪郭を描いています。E' は舌側を示します。単離された切歯(B、C、F、G)では、GFP蛍光は最初に頂端切歯を覆う歯周組織(白と赤の矢印)によって回折されました。FおよびGの赤色蛍光は、非上皮細胞を標識します。歯周組織を切除することで、緑色の蛍光頸部ループ(D、H、緑色の矢印)をはっきりと遮るもののない視界を得ることができます。スケールバー = 2 mm (A,E);1.25 mm(B、F);および300μm(C、D、G、H)。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:K 14 Creのタイムラプス顕微鏡。 研究26rtTA;tetO-H2B-GFP頸椎ループ。 (A)タイムラプスのセットアップを示す概略図。(B)K14Creの代表的なz平面。R26rtTAです。tetO-H2B-GFP切歯唇頸椎ループは、主に細胞が活発に分裂する移行増幅領域においてH2B-GFPによる核標識を示す。黄色のボックスは、以下に示す拡大画像の一般的な領域を表しています。(C-K)(L-N) タイムラプス画像は、BMに対する垂直および斜めの細胞分裂を示す。 (L-N) タイムラプス画像は、BMに対する水平方向の細胞分裂の例を示しています。 (D,G,J,M) 中期または後期の細胞は、中央のパネルに表示されます。各トラッキングされた分割の回路図を右側に示します。スケールバー in N = 36 μm (B);5 μm(C-N)。略語:BM = 基底膜。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Figure 6: K 14 Creのタイムラプス顕微鏡。R26mT/mG頸椎ループ。 (A)K14Creの代表的なz平面。R26mT/mG 切歯唇頸部ループ。すべての上皮細胞は膜GFPを発現します。黄色のボックスは、拡大図で示された細胞追跡の領域を表します。(B-G)BMに対する(B-D)水平細胞分裂と(E-G)垂直細胞分裂の両方を捉えたタイムラプス画像(C,F)中央のパネルは、有糸分裂細胞の丸みを示しています。各トラッキングされた分割の回路図を右側に示します。スケールバー = 35 μm (A);5μm(B-G)。略語:BM = 基底膜。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図S1:自家製灌流ディッシュ。 (A)35mmの培養皿を使用して灌流皿を作ることができます。倒立顕微鏡でイメージングを行う場合は、ガラス底のディッシュを使用できます。(B)釘を炎で加熱します。(C)熱した釘を使って、皿の両側に2つの開口部(白い矢じり)を作ります。(D)2本の鈍い端の16G針を、1本をメディアインレットとして、もう1本をメディアアウトレットとして、エポキシ接着剤を使用して開口部に貼り付けます。ガス灌流が必要な場合は、3番目の開口部/針を皿に追加できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオS1: K14Creのライブイメージング。R26rtTAです。tetO-H2B-GFP 切歯唇頸椎ループ、垂直および斜めの細胞分裂を示す。 セルは手動で追跡され、異なる色のドットは異なる母/娘セルのペアを表します。スケールバー = 30 μm (左フレーム);7 μm(右フレーム)。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオS2: K14Creのライブイメージング。R26rtTAです。tetO-H2B-GFP 切歯唇頸椎ループ、水平細胞分裂の一例を示す。 水平方向の分割は 10 秒のマークで行われ、青いドットを使用して手動で追跡されます。スケールバー = 30 μm (左フレーム);7 μm(右フレーム)。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオS3: K14Creのライブイメージング。R26mT/mG 切歯唇頸椎ループ、垂直および水平両方の細胞分裂を示す。 セルは手動で追跡され、異なる色の円は母/娘セルの異なるペアを表します。スケールバー = 30 μm (左フレーム);7 μm(右フレーム)。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
生組織イメージングは、細胞がニッチな環境で維持されるときの細胞の動的なプロセスと挙動を研究することを可能にする重要な技術です41。理想的には、ライブイメージングは、高い時空間分解能で in vivo で行われます。しかし、哺乳類器官の in vivo イメージングは、組織へのアクセス不能、光学的不透明性、および動物または器官を長期間固定することの難しさのために困難な場合がある42。組織外植片は、これらの課題のいくつかを回避し、歯の形態形成や外胚葉器官の発達中など、細胞の挙動を追跡するための多くの研究で成功裏に採用されています26。ここでは、培養した成体マウス切歯の深部組織イメージングをライブで行うための、比較的シンプルかつ堅牢なプロトコルを実証しました。この技術を応用することで、歯の再生における細胞の動き、運命の決定、組織組織の制御を理解することができます。
細胞分裂は容易に観察できるイベントであり、再生組織の特徴であるため、この研究では分裂細胞の追跡に焦点を当て、プロトコルの1つの使用法を強調しました。我々は、切歯上皮前駆細胞が垂直分裂と水平分裂の両方を受けることができることを発見し、したがって他の上皮組織と類似している43。分裂角を調節する機構を解明し、細胞の運命決定における分裂配向の役割を調べることは、今後の研究で重要となるでしょう。蛍光細胞運命マーカー、シグナル伝達経路レポーター、またはFucci細胞周期レポーター44,45も持つさまざまなマウス遺伝子モデルとライブイメージングを組み合わせることで、細胞分裂パターンと細胞周期動態が上皮の恒常性と再生の調節にどのように寄与するかを明らかにするのに役立ちます。
このプロトコルで必要な実践は、迅速かつ慎重な方法で歯の解剖を行い、適切な培養条件下で無傷の組織への迅速な移行と保存を可能にすることです。我々は、生体イメージングにおいて、タンパク質やmRNAの抽出を目的とした実験のように、冷たい培地ではなく、温かい培地で組織を解剖することで、細胞を機能的な状態に維持することを発見しました46。切歯は培養のための比較的大きな器官であるため、培地灌流による栄養素の安定した供給も、イメージング全体を通して組織の維持に重要である47。前駆細胞が関心領域に存在する場合、頻繁な細胞分裂の観察は、組織が健康で活動的であることを示す良い指標です。対照的に、細胞死はまれであるべきであり、これは、核マーカーが使用される場合、イメージング中に明るく凝縮した核体を検出することによって、またはイメージングおよび組織固定後にTUNEL染色を行うことによって検証することができる48。栄養素に加えて、酸素濃度または酸素不足のいずれかが細胞の生存、増殖、および分化を混乱させる可能性があるため、酸素レベルも外植片の生存率に影響を与える可能性があります49,50,51。私たちの経験では、イメージング中に追加の酸素(例えば、95% O2/5% CO2 カルボゲンまたは5% CO2/21% O2/平衡N2)の有無にかかわらずサンプルを提供した場合、細胞増殖と細胞死に明らかな違いは観察されておらず、システム内の微量の酸素が切歯上皮を培養中に一晩維持するのに十分であるか、組織が正常な細胞機能を維持するために代替経路を採用できることを示唆しています52.ただし、他の細胞プロセスまたは正しい遺伝子発現における酸素の要件は、将来の研究でさらに決定する必要があります。
プロトコルのデモンストレーションでは、遺伝的にコードされたH2B-GFPと膜GFPを使用して、それぞれ細胞核と輪郭を標識しました。これらの蛍光マーカーは、2光子顕微鏡下で明るく長持ちするため、細胞の動きや分裂を追跡するための理想的な標識の例です。理論的には、蛍光バイタル色素は、 ex vivo ライブイメージングのために異なる細胞内コンパートメントを標識するためにも使用できる53が、より深い上皮細胞への色素の浸透が減少すると、それらの使用が制限される可能性が高い。同様に、標準的な共焦点顕微鏡は100μm以下の深さで高解像度のライブイメージングが可能ですが、2光子顕微鏡は、光退色と光毒性を低減してイメージングの深さを増します54。そのため、ほとんどのライブイメージングアプリケーションにおいて、イメージングモダリティとして2光子顕微鏡を選択しました。
このプロトコルの1つの潜在的な制限は切歯のexplantsが十分に生体内の環境および生物学をrecaptulateしないかもしれないことである。したがって、データは培養条件下での細胞挙動を表しており、それに応じて解釈し、該当する場合は組織学などの他の方法を使用して検証する必要があります。また、画像診断のために子宮頸部ループにアクセスするために、歯周組織を部分的に切除する必要がありました。したがって、歯周組織と歯上皮の間のシグナル伝達相互作用が破壊される可能性があります。最後に、培地灌流は培養組織の生存率を大幅に改善しますが、異所性機械的信号として作用し、結果に影響を与える流体せん断応力を導入する可能性があります55,56。セットアップにおける異なる流量の影響は決定していません。しかしながら、1〜5mL/hの低流量は、典型的には栄養供給57を維持するのに十分であるので、せん断応力の影響を最小限にすることができる。これらの制限を念頭に置いて、ex vivoライブイメージングは、適切なコントロールを実験に含めた場合の細胞挙動の変化を研究するための強力なプラットフォームとして機能します。
連続的に成長するマウス切歯は、幹細胞ベースの組織再生と損傷修復を研究するための扱いやすいモデルシステムです。本プロトコルは、成人切歯全体を培養中に維持し、タイムラプス顕微鏡法による細胞挙動に関する時空間情報を抽出する手段を研究者に提供する。この技術は、歯科研究で使用されるさまざまなマウス遺伝子モデルの研究に広く適用でき、歯科再生の分野における知識の進歩に役立つと期待されています。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)の先端光学顕微鏡/分光法研究所とカリフォルニアナノシステム研究所(RRID:SCR_022789)のライカマイクロシステムセンターオブエクセレンスが、2光子顕微鏡を提供してくれたことに感謝します。ASは、イスラエル科学財団のISF 604-21の支援を受けました。JHは、NIH/NIDCRのR03DE030205とR01DE030471の支援を受けました。ASとJHは、米国・イスラエル二国間科学財団(BSF)からの助成金2021007の支援も受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well, flat bottom tissue culture plate | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | 11507704 | |
| Ascorbic acid (Vitamin C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-Glucose bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T system | Bioptechs | 0420-4 | Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup |
| Dissection microscope- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Basal media without phenol red |
| Feather surgical blade (#15) | Feather | 72044-15 | |
| Fine forceps | F.S.T | 11252-23 | |
| Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Glutamine substitute |
| Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | n/a | |
| low-melting agarose | NuSieve | 50080 | |
| non-essential amino acids (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| penicillin–streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Petri dish | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| Rat serum | Valley Biomedical | AS3061SC | Processed for live imaging |
| Razor blade #9 | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 | |
| Scissors | F.S.T | 37133 | |
| serrated forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| spring scissors | F.S.T | 91500-09 |
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