Evitare osmotica Caenorhabditis elegans: Funzione sinaptica di due geni, ortologhi di Human NRXN1 E NLGN1, Come candidati per l'autismo

Ciao, mi chiamo Manuel Ruiz Rubio qui al Dipartimento di Genetica dell'Università di Cordova in Spagna. Stiamo usando l'eleganza come strumento sperimentale nello studio dell'autismo, approfittando del sistema nervoso caratterizzato dal mondo di tre eleganza. Stiamo studiando il mutante del nematode, efficace nei geni coinvolti nella sinapsi neurale e che è stato correlato all'autismo.

Le redini regane sono molecole di adesione alla membrana presenti nel sinaptico. La testa di C elegance contiene l'amfi, un organo sensoriale del nematode con risposte mediate a diversi stimoli tra cui la forza osmotica. Amfi è costituito da 12 biponeuroni sensoriali con relativa altezza e un'azione terminale INAP.

Due di questi neuroni Nome A SH destro e sinistro sono particolarmente importanti nella funzione sensoriale osmotica. Rilevamento del riequilibrio solubile in acqua con elevata forza osmotica. Ciao, un vino del fiume Nan con il metodo del cielo per misurare l'evitamento osmotico nei mutanti del difetto delle sinapsi di The ance.

Per valutare le implicazioni della neuro e dell'evitamento della forza osmotica neuro alta, abbiamo riportato la diversa risposta del C contro i mutanti difettosi nei geni neuroneuroneurali utilizzando un metodo basato su una soluzione di fruttosio a quattro molari. Suonare il giorno del dire, preparare una soluzione madre a quattro molari di fruttosio con l'1% di rosso Congo e sciogliere completamente a temperatura ambiente. L'anello anulare di un centimetro di diametro sulla piastra NGM è una linea sottile al centro del mezzo solido.

Utilizzando 15 microlitri della soluzione di fruttosio rosso a quattro molari. Lascia che il fruttosio si impregni nell'acro per circa cinque minuti, l'esperimento dovrebbe essere eseguito alla cieca. La piastra con ogni ceppo che deve essere S otto dovrebbe essere etichettata da un secondo sperimentatore.

La SA viene eseguita utilizzando questi segni che non sono richiesti. Quando l'esperimento è terminato circa 24 ore prima che la vendita venga effettuata, è necessario prelevare L quattro larve di ciascun genotipo e trasferirle su una piastra AFL NGM contenente batteri e coli e mantenerla a 20 gradi Celsius il giorno successivo. L'esperimento dovrebbe essere iniziato con giovani adulti.

Metti il singolo verme di ogni ceppo all'interno del cerchio di riposo e segui ogni animale fino al momento della sua risposta alla barriera tic. 10 animali di ogni ceppo e un minimo di tre esperimenti di replica dovrebbero essere eseguiti per ottenere un risultato conclusivo. Quelli che evitano l'anello rosso sei volte di seguito sono classificati come normali.

Coloro che escono dall'anello in meno di sei tentativi sono considerati difettosi nel controllo della sensibilità all'osmosi il ceppo deve essere utilizzato in ogni SA Bristol e due animali vengono utilizzati come controlli positivi perché devono evitare la barriera dell'anello. Ceppi di controllo Rispondono andando all'indietro quando trovano una barriera osmotica costituita da quattro molari di fruttosio. Le bombe mutanti neuro deficienti hanno un comportamento simile a questi rispetto a un tipo di forza.

Tuttavia, i mutanti carenti di NEUR non sono riusciti a rilevare questa barriera osmotica. Le doppie forze mutanti car in diversi alleli neur e nout hanno recuperato il fenotipo wild type che risponde alla forza osmotica per ottenere Of down worms mediante interferenza dell'RNA che alimenta colonie isolate di e coli HD 11 cinque ceppo che è stato trasformato con vettore L 44 40 contenente un frammento corrispondente al gene bersaglio. I batteri vengono isolati su LBA o piastra con carbonico il giorno successivo.

Scegli una colonia di batteri e inoculare il terreno liquido LV. Continua a crescere per circa sette ore agitando a 37 gradi. Vedere la goccia di questa coltura su piastra NGM con soffitto carbonico e IPTG e passare una notte a temperatura ambiente, permettendo ai batteri di crescere e iniziando l'induzione dell'espressione del frammento del gene bersaglio.

È necessario utilizzare un controllo positivo e non negativo per l'interferenza dell'RNA. Esperimenti di alimentazione. Il controllo negativo è uguale.

I HT 11 cinque ceppi trasformati con vettore TL 44 40. Il positivo controlla ELI HT 11 a cinque cellule trasformate con il vettore L 44 40 contenente una sequenza di 22 geni. Il blocco di questo gene origina un fenotipo tremante facilmente distinguibile al microscopio sterile.

Il primo giorno. L quelli a quattro stadi di NGM PLA con batteri vengono trasferiti su piastra con batteri e Kuwait a 20 gradi Celsius per 12 ore. Questo è un periodo di digiuno.

Il giorno successivo spostare il giovane adulto veloce su una piastra inoculata con batteri che esprimono il gene bersaglio specifico dell'interferenza dell'RNA. Lasciare circa 48 ore a 20 gradi Celsius per ottenere la progenie F1. Quindi raccogli alcune bombe F1 adulte su un'altra piastra inoculata con gli stessi batteri nei due giorni successivi.

Selezionare e isolare i giovani adulti dalla progenie F due Punteggio per fenotipi Bristol N due ceppo selvatico grasso con batteri che si verificano empatia. Il vettore L 44 40 andava all'indietro quando va bene. La Barriera osmotica.

Bristol E vero ceppo di tipo bianco alimentato con batteri che esprimono un frammento del gene neur dall'eleganza non è riuscito a rilevare le dita dei piedi per le soluzioni molari. Tuttavia, il mutante neur carente incapace di rilevare la barriera osmotica ha recuperato questa capacità quando è stato alimentato con batteri che esprimono un frammento del gene nane From sea elegance. In questo video, mostriamo un metodo semplice che permette di studiare l'effetto dei geni che influenzano la risposta di evitamento osmotico nell'eleganza del mare.

Un anello di fruttosio formale stretto con Congo Red viene utilizzato per analizzare la risposta della bomba alla forza osmotica. La neurologia nei mutanti carenti è difettosa in questa risposta, tuttavia, i mutanti NU non sono compromessi nel rilevare lo stress tomo mostrando una risposta simile al ceppo wild type. Questo video mostra che ceppi doppi mutanti portatori di diversi alleli knockout tivi nell'ing e nel rilascio dei geni hanno recuperato il fenotipo wild type che risponde alla forza osmotica.

Queste osservazioni sono state confermate utilizzando l'interferenza dell'RNA, l'approccio di blocco dell'alimentazione. In questo modo, il ceppo wild type è stato compromesso nel riconoscere la barriera osmotica quando è stato alimentato con batteri che esprimono la sequenza corrispondente del gene ING. D'altra parte, i mutanti neuro difettosi, che non sono in grado di rilevare le altre quattro soluzioni di fruttosio, hanno recuperato questo comportamento quando sono stati alimentati con batteri che esprimono la sequenza corrispondente del gene NNU.

I risultati mostrati in questo esperimento indicano che n seeing e neur potrebbero essere coinvolti nella connessione sinaptica dei neuroni sensore del nematode e anche che interagiscono tra loro in un modo che influenza la funzione sinaptica. Ok, arrivederci e buona fortuna con i tuoi esperimenti.