Evitare osmotica Caenorhabditis elegans: Funzione sinaptica di due geni, ortologhi di Human NRXN1 E NLGN1, Come candidati per l'autismo

Salve, mi chiamo Manuel Ruiz Rubio, sono presso il Dipartimento di Genetica dell'Università di Cordova in Spagna. Stiamo utilizzando Caenorhabditis elegans come strumento sperimentale nello studio dell'autismo, sfruttando il sistema nervoso completamente caratterizzato di questo organismo. Stiamo analizzando mutanti del nematode privi di geni coinvolti nella sinapsi neurale e associati all'autismo.

Le neuregine sono molecole di adesione della membrana presenti nella sinapsi. La testa di C. elegans contiene l'amfide, un organo sensoriale del nematode che media le risposte a diversi stimoli, inclusa la forza osmotica. L'amfide è composto da 12 neuroni sensoriali bipolari con dendriti ciliati e un assone terminale presinaptico.

Due di questi neuroni, chiamati ASHR e ASHL, sono particolarmente importanti nella funzione sensoriale osmotica, poiché rilevano repellenti solubili in acqua con elevata forza osmotica. Ecco un metodo basato su un anello di fruttosio 4M per misurare l'evitamento osmotico in mutanti del C. elegans con difetti sinaptici.

Per valutare le implicazioni di neurexina e neuroligina nell'evitamento di elevata forza osmotica, riportiamo la risposta differenziale di C. elegans a mutanti difettosi nei geni nrx-1 e nlg-1, utilizzando un metodo basato su una soluzione di fruttosio 4 M. Nel giorno dell'esperimento, preparare una soluzione madre di fruttosio 4 M con l'1% di rosso Congo, sciogliendo completamente a temperatura ambiente. Tracciare un anello di un centimetro di diametro sull'agar NGM, posizionandolo al centro del mezzo solido.

Utilizzando 15 microlitri della soluzione rossa di fruttosio quattro molare. Lasciare assorbire il fruttosio nell'area circostante per circa cinque minuti. L'esperimento deve essere eseguito in cieco. La piastra con ciascun ceppo da testare deve essere etichettata da un secondo sperimentatore.

L'SA viene eseguita utilizzando questi marcatori che vengono forniti spontaneamente. Quando l'esperimento è terminato, circa 24 ore prima dell'esecuzione della prova, è necessario selezionare quattro larve per ogni genotipo e trasferirle su una piastra AFL NGM contenente batteri e coli, mantenendole a 20 gradi Celsius fino al giorno successivo. L'esperimento deve essere avviato con adulti giovani.

Posizionare un singolo verme di ciascun ceppo all'interno del cerchio di riposo e seguire ogni animale per registrare il tempo di risposta alla barriera con il tic. Per ottenere un risultato conclusivo, devono essere testati 10 animali per ogni ceppo e devono essere eseguiti almeno tre esperimenti replicati. Gli individui che evitano l'anello rosso per sei volte consecutive vengono classificati come normali.

I soggetti che escono dall'anello in meno di sei tentativi sono considerati difettosi nel controllo della sensibilità all'osmosi; deve essere utilizzata una ceppa di controllo SA Bristol e due animali vengono impiegati come controlli positivi poiché evitano l'ostacolo costituito dall'anello. I ceppi di controllo rispondono arretrando quando incontrano una barriera osmotica costituita da fruttosio 4 M. I mutanti carenti di neurodifine mostrano un comportamento simile a questi rispetto alla forza del tipo uno.

Tuttavia, i mutanti carenti di NEUR non sono riusciti a rilevare questa barriera osmotica. I doppio mutanti per diversi alleli di neur e nout hanno recuperato il fenotipo selvatico, rispondendo alla forza osmotica per ottenere vermi Of down mediante alimentazione con interferenza dell'RNA. Isolare colonie del ceppo di E. coli HD11.5 che è stato trasformato con il vettore L4440 contenente un frammento corrispondente al gene bersaglio. Il giorno successivo, isolare i batteri su piastra LBA o con carbonico.

Prelevare una colonia di batteri e inoculare il mezzo liquido LV. Far crescere per circa sette ore con agitazione a 37 gradi. Vedere la goccia di questa coltura su una piastra NGM con tetto di carbonato e IPTG e lasciare in incubazione tutta la notte a temperatura ambiente, permettendo ai batteri di crescere e avviando l'induzione dell'espressione del frammento del gene bersaglio.

È necessario utilizzare un controllo positivo e un controllo non negativo per l'interferenza dell'RNA. Esperimenti di alimentazione. Il controllo negativo è uguale.

Stirpe I HT 11 cinque trasformata con il vettore TL 44 40. I controlli positivi sono cellule ELI HT 11 cinque trasformate con il vettore L 44 40 contenente una sequenza del gene 22. L'inattivazione di questo gene origina un fenotipo di tremolio facilmente distinguibile al microscopio sterile.

Primo giorno. Quattro larve di stadio L1 provenienti da piastre NGM con batteri vengono trasferite su una piastra contenente batteri e Kuwait a 20 gradi Celsius per 12 ore. Questo è un periodo di digiuno.

Il giorno successivo, trasferire il giovane adulto veloce su una piastra inoculata con batteri che esprimono il gene bersaglio specifico dell'interferenza dell'RNA. Lasciare per circa 48 ore a 20 gradi Celsius per ottenere la progenie F1. Successivamente, selezionare alcuni adulti F1 bomba su un'altra piastra inoculata con gli stessi batteri nei due giorni successivi.

Selezionare e isolare giovani adulti dalla progenie F2, valutando i fenotipi del ceppo selvatico Bristol N2 grasso con batteri che presentano empatia. Il vettore L 44 40 stava andando all'indietro quando era fine. La barriera osmotica.

Il ceppo di tipo selvatico Bristol And true white alimentato con batteri che esprimono un frammento del gene neur da elegance non è riuscito a rilevare le soluzioni molariche di tossine. Tuttavia, il mutante carente di neur, incapace di rilevare la barriera osmotica, ha recuperato questa capacità quando è stato alimentato con batteri che esprimono un frammento del gene nane da sea elegance. In questo video, mostriamo un metodo semplice che permette di studiare l'effetto dei geni che influenzano la risposta di evitamento osmotico in sea elegance.

Un anello di fruttosio formalizzato con Rosso Congo viene utilizzato per analizzare la risposta del verme alla forza osmotica. I mutanti carenti di neuroligina sono difettosi in questa risposta, tuttavia i mutanti NU non risultano compromessi nel rilevare lo stress osmotico, mostrando una risposta simile a quella della ceppa selvatica. Questo video mostra che ceppi mutanti doppi portatori di diversi alleli knockout in geni coinvolti nella formazione e nel rilascio sinaptico recuperano il fenotipo selvatico rispondendo alla forza osmotica.

Queste osservazioni sono state confermate utilizzando l'interferenza dell'RNA, con un approccio di blocco alimentare. In questo modo, la linea selvatica è risultata compromessa nel riconoscimento della barriera osmotica quando è stata nutrita con batteri che esprimevano la sequenza corrispondente del gene ING. D'altro canto, i mutanti difettivi in neur, che non sono in grado di rilevare la soluzione di fruttosio più concentrata, hanno recuperato questo comportamento quando sono stati nutriti con batteri che esprimevano la sequenza corrispondente del gene NNU.

I risultati mostrati in questo esperimento indicano che nrx-1 e nlg-1 potrebbero essere coinvolti nella connessione sinaptica dei neuroni sensoriali del nematode e anche che interagiscono l'uno con l'altro in un modo che influisce sulla funzione sinaptica. Ok, arrivederci e buona fortuna con i vostri esperimenti.