L'adesione e aggregazione piastrinica in condizioni di flusso utilizzando celle di flusso Microfluidic

Il sistema bio flux è uno strumento automatizzato e un dispositivo microfluidico per l'esecuzione di saggi su cellule vive a flusso puro controllato. Questo sistema utilizza la tecnologia microfluidica delle piastre a pozzetti per integrare i dispositivi a celle di flusso su scala micron nelle piastre a pozzetti standard SBS. BioFlex può essere utilizzato per condurre studi di adesione e aggregazione piastrinica con un'elevata produttività e volumi di sangue ridotti.

Il sangue intero marcato con colorante fluorescente viene aggiunto ai pozzetti e poi fatto fluire attraverso i canali. In condizioni di flusso controllato, vengono prodotti dati di microscopia ad alta risoluzione, che quantificano l'adesione e l'aggregazione piastrinica in presenza di composti farmacologici e altri parametri variabili. Ciao, sono Mike Schwartz del laboratorio RD di Flexion Biosciences.

Oggi vi mostreremo una procedura per l'uso di celle a flusso microfluidiche nei saggi di adesione piastrinica. Utilizziamo questo protocollo nel nostro laboratorio per una varietà di saggi di biologia vascolare. Quindi iniziamo.

Prima di eseguire l'esperimento con la cella di flusso, i canali microfluidici della piastra di flusso bio devono essere preparati con un rivestimento proteico di collagene di interesse che verrà utilizzato in questo esperimento. Ciascuno dei 24 canali sperimentali della piastra di flusso bio si collega a un pozzetto di ingresso e a un pozzetto di uscita per questa piastra. Il pozzetto di ingresso è il pozzetto di sinistra che alimenta il canale e il pozzetto di uscita è a destra, diluire il ceppo di collagene a una concentrazione di 200 microgrammi per millilitro.

Nell'acido acetico molare 0,02, saranno necessari 20 microlitri per ogni canale utilizzato. Poiché questo esperimento richiede 11 canali, crea 200 microlitri di rivestimento di collagene. Un canale rimane non rivestito e mescolato mediante una delicata iterazione con una punta per micropipetta.

Aggiungere 20 microlitri di rivestimento a ciascun rispettivo canale utilizzando una micropipetta per erogare il liquido nel punch interno del pozzetto. L'alimentazione del canale microfluidico di interesse, come mostrato qui con il colorante giallo, include un canale senza collagene come controllo negativo per l'adesione e l'aggregazione piastrinica. Dopo che il rivestimento di collagene è stato aggiunto a tutti i rispettivi canali, collegare l'interfaccia alla piastra.

Se si utilizza l'interfaccia bio flux 1000, è possibile fissare entrambi i fermi sul tavolino. Se si utilizza l'interfaccia Bio flux 200 con il primo dito, serrare le quattro viti. E poi, una volta che sono tutti pronti, usa il cacciavite dinamometrico per serrare completamente.

Il cacciavite di coppia scatterà quando raggiunge il massimo. Utilizzando la modalità manuale del software bio flux, applicare la perfusione ai canali di interesse a 2D per centimetro quadrato dall'uscita. Utilizzare un obiettivo a bassa potenza su un microscopio per trovare il pozzetto di ingresso e osservare il punzone interno opposto che viene riempito di liquido.

Dovresti prima vedere una piccola quantità di liquido, che riempie lentamente il punzone interno dopo diversi minuti e quando il punzone interno di ingresso è pieno, interrompi la profusione su tutti i canali premendo stop nel software. Incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora. Durante questo periodo di incubazione, è possibile iniziare a preparare il sangue intero alla fine dell'incubazione di un'ora.

Una volta preparato il sangue, rimuovere l'interfaccia e aggiungere un millilitro di PBS più ioni calcio e magnesio all'uscita. Bene, inizia bene la profusione dall'uscita a due cene per centimetro quadrato e continua la profusione per 10 minuti. Dopo 10 minuti, interrompere la profusione Dopo aver rimosso l'interfaccia, rimuovere il PBS in eccesso sia dai pozzetti di ingresso che da quelli di uscita.

Non rimuovere mai il liquido che riempie il punzone interno. Per bloccare i canali, aggiungere un millilitro di soluzione bloccante a ciascuna presa. Bene da utilizzare perfondere dal pozzo di uscita a due dosi per centimetro quadrato e continuare la perfusione per 10 minuti.

Interrompere la profusione dopo 10 minuti e rimuovere l'interfaccia. I canali sono ora pronti e possono essere utilizzati per tutto il giorno mentre la lastra viene rivestita di collagene. Durante un'incubazione di un'ora, il sangue umano fresco di un individuo a digiuno deve essere preparato per l'imaging e per l'esecuzione nella piastra.

Il sangue deve essere aspirato in citrato di sodio, anticoagulante e utilizzato entro tre ore dal prelievo. Innanzitutto, aggiungere al sangue una scorta di quattro millimolari di calcio M in DMSO a una diluizione da uno a 1000 volumi per volume. Per ottenere quattro micromolari di calcio sono mescolato mediante leggera inversione.

Quindi, erogare un millilitro di sangue marcato con calcio am in dieci microprovette da uno virgola cinque millilitri. Aggiungere l'anticorpo inibitore GP two B three a ciascuna provetta alla diluizione desiderata. Assicurati di includere un controllo negativo senza anticorpi e un controllo positivo con anticorpi non correlati mescolati con una leggera inversione.

Incubare le provette a temperatura ambiente per un'ora, mescolando mediante inversione delicata ogni 10 minuti prima di eseguire l'esperimento con cella a flusso. Nel modulo di controllo del flusso bio deve essere impostato un protocollo automatizzato per il collagene. Uno. Imposta un protocollo per far scorrere il sangue a diecinove centimetri quadrati per 10 minuti dall'uscita.

Bene, utilizzando la workstation BioFlex 1000 è necessario impostare i parametri di acquisizione dati, che includono l'acquisizione delle posizioni dello stadio desiderate nella lunghezza d'onda fitz e l'impostazione del time-lapse. Un tipico piano di acquisizione delle immagini per questo protocollo comprenderebbe un campo visivo per canale da acquisire utilizzando un obiettivo 10 volte ogni 30 secondi per una durata totale di 10 minuti. Sono inoltre possibili ulteriori campi visivi e impostazioni TimeLapse alternative.

Una volta impostati il protocollo automatizzato e i parametri di acquisizione dati, tornare alla piastra BioFlex e rimuovere il liquido su entrambi i lati del canale ad eccezione dei punzoni interni. Avendo cura di lavorare rapidamente, inserire 500 microlitri di sangue di ciascuna condizione nei pozzetti di uscita di ciascun canale. Si noti che i pozzetti di uscita vengono utilizzati per erogare il sangue perché è il percorso più breve per la zona di visualizzazione e fornirà una reazione più immediata del sangue al rivestimento di collagene.

Inoltre, posizionare il sangue di controllo senza anticorpi in un canale rivestito di collagene e uno che è appena bloccato. Posizionare la piastra sul microscopio per workstation BioFlex 1000 e bloccarla sull'interfaccia. Eseguire la calibrazione dell'elenco delle fasi individuando il primo punto di calibrazione definito come origine.

Quindi individuare e contrassegnare il secondo punto di calibrazione. Applicare questa calibrazione all'elenco delle fasi appropriato. In questo modo si garantisce che tutte le posizioni di visualizzazione sulla lastra possano essere trovate automaticamente.

Spostare il tavolino su uno dei canali contenenti il set di sangue, i parametri di acquisizione delle immagini, come il tempo di esposizione e il guadagno, nel software di montaggio BioFlex. Avvia il flusso di lavoro appropriato facendo clic sul pulsante desiderato. In questo modo verranno avviati contemporaneamente il protocollo di flusso e l'acquisizione delle immagini.

Al termine dell'esperimento, rimuovere la piastra dalla postazione di lavoro BIOFLU 1000 e smaltirla secondo le linee guida istituzionali. Utilizzando canali microfluidici rivestiti di collagene del sistema bio flux. La formazione di trombi aggressivi si osserva nel tempo con il campione di sangue di controllo non trattato.

Al contrario, non si osserva alcuna formazione di trombi con il canale non rivestito. In un esperimento condotto di recente, la dimensione media degli aggregati in condizioni di controllo era di 2000 micrometri quadrati. GP due B tre A è un potente mediatore delle interazioni piastriniche piastriniche e della stabilizzazione dell'aggregazione quando attivato dall'adesione al collagene, come mostrato qui dopo l'incubazione con anticorpo anti GB due B tre a per un'ora prima della pura esposizione, si osserva una diminuzione delle dimensioni dei trombi e una diminuzione della frequenza di formazione di trombi.

Una risposta dose-dipendente può essere tipicamente osservata a diecinove centimetri quadrati e il valore IC 50 per questo particolare inibitore era di 17 nanomolari. L'inibizione massima per questo donatore rispetto al controllo senza anticorpi è stata dell'11% a 10 centimetri quadrati. È disponibile anche una piastra di taglio a 48 pozzetti per l'esecuzione di esperimenti su sangue intero fino a 200 D per centimetro quadrato o 5.000 secondi inversi.

Ti abbiamo appena mostrato come utilizzare i canali di flusso microfluidici per condurre esperimenti di biologia vascolare fisiologicamente rilevanti. Quando si esegue questo protocollo, è importante ricordare di diluire il collagene nel tampone corretto. Utilizzare sempre la tecnica di pipettaggio corretta per evitare l'introduzione di bolle d'aria e seguire sempre le norme di biosicurezza del laboratorio.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.