Un test basato sul flusso laminare per studiare le interazioni tra leucociti e cellule endoteliali

Iniziare posizionando un vetrino con un monostrato endoteliale aderente stimolato da citochine in una camera di flusso.

Queste cellule endoteliali esprimono molecole di adesione superficiale, come le selectine, e segnali migratori legati all'endotelio, come le chemochine.

Introdurre leucociti marcati in fluorescenza nella camera di flusso.

Quando i leucociti fluiscono sul monostrato endoteliale, interagiscono con le cellule endoteliali attivate.

Le selectine sulle cellule endoteliali si legano ai ligandi corrispondenti sui leucociti.

Le interazioni selectina-ligando sono deboli e transitorie, consentendo ai leucociti di rotolare lungo il monostrato endoteliale sotto la forza di un mezzo che scorre.

Il rotolamento consente ai leucociti di interagire con le chemochine, attivando le integrine e promuovendo l'arresto solido dei leucociti.

Successivamente, i leucociti si diffondono attraverso il monostrato endoteliale, indicando il loro potenziale di trasmigrazione, un passaggio cruciale nella risposta immunitaria.

Questo test aiuta a studiare il meccanismo di aderenza, deadesione e trasmigrazione dei leucociti durante la loro perfusione sulle cellule endoteliali.

Utilizzare un micromolare di colorante di acido nucleico fluorescente verde permeabile alle cellule per etichettare in modo fluorescente i leucociti. Dopo la marcatura, incubare i leucociti per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, centrifugare le celle a 300 volte g per 5 minuti per pellettare le cellule.

Risospendere in soluzione salina tamponata con fosfato per lavare le cellule. Quindi, centrifugare le cellule a 300 volte g per 5 minuti. In base alla velocità di flusso, sospendere 5 millilitri di cellule nel tampone di analisi. Quindi, scaldare un bagnomaria per mantenere i 37 gradi Celsius.

Quindi, metti da parte una siringa di perfusione da 50 millilitri e installala sul supporto della siringa. Quindi, impostare la pompa in modalità di estrazione, con il volume della pompa a 0 millilitri e il diametro a 26,70 millimetri. Quindi, collegare un accoppiatore Luer-lock alla siringa e collegare il tubo con il connettore luer a gomito all'accoppiatore Luer-lock. Quindi, collegare l'estremità libera del tubo alla camera di flusso. Per far aderire i leucociti alle piastrine immobilizzate, collegare il vetrino con la siringa.

Per perfondere i leucociti e quindi aderire a un letto di monostrato vascolare o piastrinico, collegare un secondo tubo a una provetta conica da 50 millilitri contenente il tampone del test, quindi riempire il tubo utilizzando una pipetta da 1 millilitro. Una volta riempito il tubo, strizzarlo e collegarlo alla camera di flusso. Prima di perfondere i leucociti, aggiungere 3 millimolari di cloruro di calcio e 2 millimolari di cloruro di magnesio alla sospensione cellulare. Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 5 minuti.

Per rimuovere l'eventuale aria bloccata nella camera e nel tubo, perfondere con il tampone di saggio prima di perfondere le cellule. Quindi, premere le provette per chiudere l'estremità e commutare il tubo dal tampone del saggio alla sospensione cellulare, evitando così l'intrappolamento di bolle d'aria all'interno.

Per l'arrivo delle prime celle, perfondere le celle alla velocità di flusso e allo sforzo di taglio appropriati. Continuare a perfondere le celle, mantenendo la portata e lo sforzo di taglio per due minuti. Quindi, cattura sei immagini delle cellule rotanti e deterrenti tra 2 e 6 minuti utilizzando un microscopio a fluorescenza con ingrandimento 10 volte collegato a una fotocamera digitale.