JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:54 min. • July 8th, 2025
Iniziare posizionando un vetrino con un monostrato endoteliale aderente stimolato da citochine in una camera di flusso.
Queste cellule endoteliali esprimono molecole di adesione superficiale, come le selectine, e segnali migratori legati all'endotelio, come le chemochine.
Introdurre leucociti marcati in fluorescenza nella camera di flusso.
Quando i leucociti fluiscono sul monostrato endoteliale, interagiscono con le cellule endoteliali attivate.
Le selectine sulle cellule endoteliali si legano ai ligandi corrispondenti sui leucociti.
Le interazioni selectina-ligando sono deboli e transitorie, consentendo ai leucociti di rotolare lungo il monostrato endoteliale sotto la forza di un mezzo che scorre.
Il rotolamento consente ai leucociti di interagire con le chemochine, attivando le integrine e promuovendo l'arresto solido dei leucociti.
Successivamente, i leucociti si diffondono attraverso il monostrato endoteliale, indicando il loro potenziale di trasmigrazione, un passaggio cruciale nella risposta immunitaria.
Questo test aiuta a studiare il meccanismo di aderenza, deadesione e trasmigrazione dei leucociti durante la loro perfusione sulle cellule endoteliali.
Utilizzare un micromolare di colorante di acido nucleico fluorescente verde permeabile alle cellule per etichettare in modo fluorescente i leucociti. Dopo la marcatura, incubare i leucociti per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, centrifugare le celle a 300 volte g per 5 minuti per pellettare le cellule.
Risospendere in soluzione salina tamponata con fosfato per lavare le cellule. Quindi, centrifugare le cellule a 300 volte g per 5 minuti. In base alla velocità di flusso, sospendere 5 millilitri di cellule nel tampone di analisi. Quindi, scaldare un bagnomaria per mantenere i 37 gradi Celsius.
Quindi, metti da parte una siringa di perfusione da 50 millilitri e installala sul supporto della siringa. Quindi, impostare la pompa in modalità di estrazione, con il volume della pompa a 0 millilitri e il diametro a 26,70 millimetri. Quindi, collegare un accoppiatore Luer-lock alla siringa e collegare il tubo con il connettore luer a gomito all'accoppiatore Luer-lock. Quindi, collegare l'estremità libera del tubo alla camera di flusso. Per far aderire i leucociti alle piastrine immobilizzate, collegare il vetrino con la siringa.
Per perfondere i leucociti e quindi aderire a un letto di monostrato vascolare o piastrinico, collegare un secondo tubo a una provetta conica da 50 millilitri contenente il tampone del test, quindi riempire il tubo utilizzando una pipetta da 1 millilitro. Una volta riempito il tubo, strizzarlo e collegarlo alla camera di flusso. Prima di perfondere i leucociti, aggiungere 3 millimolari di cloruro di calcio e 2 millimolari di cloruro di magnesio alla sospensione cellulare. Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 5 minuti.
Per rimuovere l'eventuale aria bloccata nella camera e nel tubo, perfondere con il tampone di saggio prima di perfondere le cellule. Quindi, premere le provette per chiudere l'estremità e commutare il tubo dal tampone del saggio alla sospensione cellulare, evitando così l'intrappolamento di bolle d'aria all'interno.
Per l'arrivo delle prime celle, perfondere le celle alla velocità di flusso e allo sforzo di taglio appropriati. Continuare a perfondere le celle, mantenendo la portata e lo sforzo di taglio per due minuti. Quindi, cattura sei immagini delle cellule rotanti e deterrenti tra 2 e 6 minuti utilizzando un microscopio a fluorescenza con ingrandimento 10 volte collegato a una fotocamera digitale.