Name: Modello murino di CD40-attivazione delle cellule B (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-05T17:30:09.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Scopri l'attivazione e l'espansione di cellule B murine CD40 da splenociti di topi C57BL/6. Questo metodo permette di generare cellule presentanti l'antigene per studiare l'induzione delle risposte immunitarie in vivo.

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Ringraziamo il Dott. Clemens Wendtner per fornire tmuCD40-Ligand-HeLa linea cellulare.

Il protocollo per la generazione di murino CD40 delle cellule B attivate (mCD40B) da splenociti è diviso in due parti: la parte A dimostra la preparazione di murino CD40 ligando (CD40L) che esprime cellule HeLa (tmuCD40L HeLa), che sarà usato come piastra legato cellule nutrici. Parte B descrive l'attuale murino B CD40-cultura. A. Preparazione di cellule di alimentazione (tmuCD40L HeLa) Il HeLa tmuCD40L è un aderente linea di cellule epiteliali umane, che non dovrebbe mai diventare completamente confluenti. Le cellule sono quindi suddivisi due volte alla settimana. Coltura per più di 6 settimane non è raccomandato. <ol><li> Rimuovere medio vecchio dalla coltura primaria con una pipetta sterile e lavare le cellule con 10 ml di PBS 1x. Aspirare il PBS dopo il lavaggio. </li><li> Aggiungere 4 ml di 1x tripsina / EDTA in 75 2 centimetri a riposo per 10-15 minuti a 37 ° C. Usa picchiettando leggermente per staccare le cellule. </li><li> Aggiungere 10 ml di medium di tipo selvatico e girevole delicatamente per fermare la digestione con tripsina. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 ml con una pipetta sterile e girare le celle in basso a 265 xg per 7 minuti. </li><li> Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di medium di tipo selvatico. Contare il numero di cellulare di una aliquota della sospensione cellulare e preparare tre da 50 mL con il numero appropriato di cellule: <ol><li> 2,5 x 10 6 cellule per la subcultura </li><li> 0,4 x 10 6 cellule / pozzetto di irradiazione utilizzate nel murino CD40-B colture cellulari </li><li> resto di congelare (se necessario). </li></ol></li><li> Spin le cellule verso il basso a 265 xg per 7 minuti. </li><li> Rimuovere il surnatante. <ol><li> Per subcolture: risospendere 2,5 x 10 6 cellule in 10 ml di medie selezione in un centimetro 75 2 pallone di coltura cellulare (cellule densità di 2,5 x 10 5 cellule / ml) e incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2. Dividere le celle due volte alla settimana. </li><li> Per la murino CD40-B coltura cellulare: Avete bisogno di 2,4 x 10 6 cellule per un 6-pozzetti. Risospendere le cellule tmuCD40L HeLa wild-type in media ad una densità di 0,2 x 10 6 cellule / ml e irradiare li a 78 Gy. Tavola 2 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto e incubare loro a 37 ° C con 5% di CO 2. Utilizzare questa piastre preparate per la stimolazione delle cellule B quando tmuCD40L cellule HeLa sono aderenti (almeno 4 ore: controllare l'aderenza con il microscopio, non aspettare più di 24 ore per iniziare la stimolazione delle cellule B). (Continua con B.) </li></ol></li></ol> B. murini CD40-B colture cellulari I. Preparazione di splenociti per CD40-stimolazione (giorno 0): Attenzione: prima di continuare a constatare che le cellule feeder siano aderenti. Aggiungere sempre soluzioni fresche di murini immediatamente interleuchina-4, β-mercaptoetanolo e ciclosporina A per il mezzo di crescita prima dell'uso. <ol><li> Sezionare milza di C57BL / 6 topi (aplotipo H-2b) e lavarlo due volte in 10-20 ml DMEM integrato con Gentamicina [15μg/mL] trasferendo con una punta da 10 ml pipetta da un tubo ad un altro. Evitare il trasferimento di contaminanti (ad esempio capelli) del mouse. Tritare milza passando attraverso un colino cella (100μm) e risciacquare con un altro filtro ml 10 di media. Spin down splenociti a 265 xg per 7 minuti a temperatura ambiente, li risospendere in 7 ml muCD40 media delle cellule-B e linfociti separati per centrifugazione densità Ficoll. Per fare questo strato di cellule, il 5 ml Mouse-Pancoll (preriscaldato a temperatura ambiente) in una provetta da 15 ml e centrifugare a 450 xg per 30 min, senza freno a temperatura ambiente. </li><li> Erogare la maggior parte dello strato superiore, lasciando il livello dei linfociti indisturbato a livello di interfaccia. Trasferimento strato linfociti ad un nuovo tubo da 50 ml, lavare una volta con DMEM 30mL con Gentamicina [15μg/mL] riducendo la velocità a 265 xg per 7 minuti per eliminare altre cellule. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 10 ml di mCD40-B medio di lavaggio. Determinare il numero di cellule in una parte aliquota della sospensione cellulare. Determinare il numero delle cellule contando una aliquota della sospensione cellulare. </li><li> Spin down la quantità necessaria di cellule a 265 xg per 7 minuti. Per un 6-pozzetti 5 x 10 6 cellule / pozzetto sono necessari, quindi 30 x 10 6 cellule per piastra. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere i linfociti a 1,25 x 10 6 cellule / ml in mCD40-B terreno di coltura fresco integrato con 1 U / mL di interleuchina-4 come fattore di crescita, 100 mM β-mercaptoetanolo e 0,63 mg / ml ciclosporina A per prevenire conseguenza di cellule T (concentrazioni indicati si riferiscono a un mezzo ml cultura!). </li><li> Eliminare il surnatante dal 6 pozzetti pre-incubate con tmuCD40L cellule HeLa. </li><li> Delicatamente aggiungere 4 ml di sospensione linfocitaria (1,25 x 10 6 cellule / ml) in ciascun pozzetto della piastra ben 6. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C con 5% di CO 2. </li> Il giorno 3 reculture le cellule (Continua con II.1.). </ol> II. Sottocultura di cellule mCD40B (giorno 3 e poi due volte a settimana): <ol><li> Grappolo di cellule raccolta mCD40B da vigorosamente pipettando su e giù con una pipetta da 10 mL e la piscina in un tubo da 50 ml. </li><li> Spin down a 265 xg per 7 minuti e sostituire completamente il sopranatante con mCD40-B medio di lavaggio. Mentre conta la quantità delle cellule di una aliquota, girare la celle in basso a 265 xg per 7 minuti. Risospendere le cellule in mCD40B mCD40-B terreno di coltura ad una concentrazione di 0,75 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Aggiungi soluzioni fresche di murini interleuchina-4 in una concentrazione di 1 U / mL, 100 mM β-mercaptoetanolo e 0,63 mg / ml ciclosporina A per la media. </li><li> Rimuovere il surnatante da un 6-pozzetti pre-incubate con irradiati tmuCD40L cellule HeLa. </li><li> Delicatamente aggiungere 4 ml di sospensione cellulare mCD40B (0,75 x 10 6 cellule / ml) in ciascun pozzetto della piastra ben 6. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Anche in questo caso le cellule sottocultura ogni 3-4 giorni per finire con elevata purezza murino CD40 delle cellule B attivate dopo un totale di 14 giorni. </li></ol> C. Soluzione dei problemi: cosa succede se le cellule B CD40-non crescono? <ol><li> Hai controllato di espressione ligando CD40 delle cellule alimentatore? </li><li> Sono legato piastra cellule alimentatore utilizzato per la stimolazione più di 24 ore? </li><li> C'è una contaminazione con micoplasma? </li><li> È stata la interleuchina-4 soluzione utilizzata per la supplementazione appena scongelati e ce l'ha l'attività biologica appropriata? </li><li> Era β-mercaptoetanolo e ciclosporina A aggiunti nella concentrazione giusta? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1a.jpg" alt="Figura 1 a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1 a"> Figura 1a. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1b.jpg" alt="Figura 1 b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1 b"> Figura 1b. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1d.jpg" alt="Figura 1 d" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1 d"> Figura 1d. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li>
<li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li>
<li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+Ligand-activated%2C+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. S. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li>
</ol>

Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida nazionali ed europee per il mantenimento degli animali da laboratorio. Riferendosi alla legge tedesca sul benessere degli animali gli animali erano controllati regolarmente dalle autorità competenti.

Le modifiche di questo protocollo sono possibili, soprattutto per quanto riguarda l&#39;origine di CD40-stimolo e il tipo di ceppo di topi utilizzati, anche cedendo nella generazione efficiente di murini CD40 delle cellule B attivate. Ahmadi et al. hanno mostrato risultati simili per i fibroblasti di topo murine transfettate con CD40-ligando. In questa presentazione contesto di xeno-antigene può essere esclusa con certezza, ma studi approfonditi in materia di sicurezza e tossicità in vivo non ha dato segni di r...

A. Preparazione dei supporti: <table border="1"><tbody><tr><td> Alimentatore cellule wild type media </td><td> Alimentatore cellulare medio selezione </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Concentrazione </td><td> Reagente </td><td> Concentrazione </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> 300 mg / ml </td><td> L-Glutammina </td><td> 300 mg / ml </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Hygromycin B </td><td> 0,2 mg / ml </td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40-B lavaggio medio </td><td> mCD40-B terreno di coltura </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Concentrazione </td><td> Reagente </td><td> Concentrazione </td></tr><tr></tr><tr><td> D-MEM </td><td> </td><td> D-MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> 580 mg / ml </td><td> L-Glutammina </td><td> 580 mg / ml </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 4,5 mg / ml </td><td> Glucosio </td><td> 4,5 mg / ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> MEM </td><td> 0.1mm (1x) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Varie Reagenti: <table border="1"><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Il decreto n. </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21875 </td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> Nessun gatto H15-011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> Delta Select </td><td> Art. n. 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> Nessun gatto DE14-802C </td></tr><tr><td> HEPES Buffer </td><td> PAA </td><td> Nessun gatto S11-001 </td></tr><tr><td> MEM NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> PAA </td><td> Nessun gatto P02-015 </td></tr><tr><td> Ricombinante murino interleuchina-4 </td><td> Immunotools </td><td> Nessun gatto 12340045 </td></tr><tr><td> Ciclosporina A </td><td> Novartis </td><td> Nessun gatto NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> Tripsina / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> C. Varie Forniture: <table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Il decreto n. </td></tr><tr><td> Puntali sterili </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6 pozzetti </td><td> NUNC </td><td> Nessun gatto 140675 </td></tr><tr><td> 50mL tubo conico </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Nessun gatto 352070 </td></tr><tr><td> Tessuto cultura fiasco </td><td> Sarstedt </td><td> Nessun gatto 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

modello murino di cd40-attivazione delle cellule b

Murine Model of CD40-activation of B cells

La ricerca sulle cellule B CD40 ha dimostrato che l&#39;attivazione di migliorare la loro capacità di presentazione dell&#39;antigene. Se stimolati con interleuchina-4 e CD40 ligando (CD40L), le cellule B umane può essere ampliato senza difficoltà da piccole quantità di sangue periferico entro 14 giorni di tempo per grandi quantità di altamente puri-CD40 delle cellule B (&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; Cellule per paziente) da donatori sani e pazienti affetti da cancro<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Cellule CD40-B esprimere importanti molecole nodo homing linfa e in grado di attrarre le cellule T<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 5</sup&gt;. Inoltre, essi occupano in modo efficiente, elaborare e presentare antigeni alle cellule T<sup&gt; 6,7</sup&gt;. Cellule CD40-B hanno dimostrato di non solo ingenuo primo, ma anche di espandere le cellule T di memoria<sup&gt; 8,9</sup&gt;. Pertanto CD40-attivate le cellule B (linfociti B CD40-) sono stati studiati come fonte alternativa di immuno-stimolatorie cellule presentanti l&#39;antigene (APC) per i cellulari basati su immunotherapy1, 5,10. Per studiare ulteriormente se le cellule CD40-B inducono efficace le risposte delle cellule T in vivo e studiare il meccanismo di base abbiamo stabilito un sistema di coltura cellulare per la generazione di murino CD40 delle cellule B attivate. Utilizzando splenociti depurati o linfociti B di topi C57BL / 6 per CD40-attivazione, le condizioni ottimali sono stati identificati come segue: A partire da splenociti di C57BL / 6 topi (aplotipo H-2b) linfociti sono purificati mediante centrifugazione a gradiente di densità e di co-coltura con HeLa cellule che esprimono ricombinante murino ligando CD40 (tmuCD40L HeLa)<sup&gt; 11</sup&gt;. Le cellule sono recultured ogni 3-4 giorni e componenti chiave, quali CD40L, interleuchina-4,-mercaptoetanolo e ciclosporina A sono reintegrati. In questo protocollo dimostriamo come ottenere pienamente attivato murino CD40 delle cellule B (mCD40B) con simili APC-fenotipo di umani CD40 delle cellule B (Fig. 1a, b). CD40-stimolazione porta ad una conseguenza rapida espansione e di elevata purezza (&gt; 90%) delle cellule CD19 + B entro 14 giorni di coltura cellulare (Fig. 1c, d). Per evitare la contaminazione con le cellule non transfettate, espressione del ligando CD40 murino sulla trasfettate deve essere controllata regolarmente (Fig. 2). Murino CD40-attivate le cellule B possono essere utilizzati per studiare l&#39;attivazione delle cellule B e la differenziazione così come per indagare il loro potenziale di funzionare come APC in vitro e in vivo. Inoltre, essi rappresentano uno strumento promettente per stabilire la vaccinazione terapeutica o preventiva contro i tumori e contribuirà a rispondere a domande riguardanti la sicurezza e l&#39;immunogenicità di questo approccio<sup&gt; 12</sup&gt;.

In questo video, dimostriamo la procedura di CD40-attivazione e l&#39;espansione delle cellule B da splenociti murini di C57BL / 6 topi, che può essere utilizzato come modello di una cellula presentanti l&#39;antigene (APC) per studiare l&#39;induzione di immunità.

Modello murino di CD40-attivazione delle cellule B

La ricerca sulle cellule B ha dimostrato che l'attivazione di CD40 ne migliori la capacità di presentazione dell'antigene. Quando stimolate con l'interleuchina-4 e il ligando di CD40...

Ciao, mi chiamo Tanya Wig e sono una studentessa di dottorato che lavora presso il laboratorio di immunologia tumorale e immunologia dei trapianti dell'Ospedale Universitario di Colonia. I miei studi si concentrano principalmente su cellule B umane attivate tramite CD40 e sulla loro capacità di indurre risposte immunitarie in vivo. In origine, le cellule B umane CD40 sono state generate come alternative alle cellule dendritiche come cellule presentanti l'antigene.Queste cellule sono destinate all'uso per scopi immunoterapeutici. In ambito clinico, le cellule B CD40 vengono generate mediante segnalazione CD40 e stimolazione con IL-4. Secondo questo sistema, possono essere espanse per diverse settimane. Dopo aver ottimizzato in laboratorio la generazione di cellule B CD40 umane da PBMC, abbiamo trasferito con successo questo principio ai topi e questo è ciò che voglio mostrarvi oggi.Partendo dalla milza, generiamo cellule B attivate da CD40 murine entro 14 giorni di coltura cellulare. I passaggi principali sono la preparazione delle cellule feeder; a tale scopo utilizziamo una linea cellulare Heer trasfettata con il ligando murino CD40, che è aderente e viene irradiata con 78 gray, quindi seminata in piastre a sei pozzetti. In secondo luogo, avviamo la coltura di cellule B CD40 murine utilizzando splenociti purificati freschi da topi C57BL/6, che vengono trattati con interleuchina-4 murina, beta-mercaptoetanolo e ciclosporina A. Successivamente, queste cellule vengono trasferite su cellule feeder irradiate in piastre a sei pozzetti.Questa procedura viene ripetuta ogni tre o quattro giorni fino al giorno 14 della coltura cellulare. Per ottenere cellule B attivate da CD40 marine altamente pure, iniziamo la generazione di cellule B attivate da CD40 marine utilizzando cellule SP purificate di recente da topi LXi tromb. Per prima cosa laviamo le cellule SP risospendendo le cellule in 50 millilitri di mezzo di lavaggio per cellule B CD40 marine.Quindi centrifugare le cellule per sette minuti a 1300 giri al minuto, corrispondenti a 260 ×g, per la determinazione del numero di cellule. Ri-sospendere accuratamente le cellule in 10 millilitri di mezzo di lavaggio marino CD 40 B e, infine, omogeneizzare le cellule mediante vortex. Determinare quindi il numero di cellule.Centrifugare la quantità richiesta di citi per sette minuti a 1300 giri/min corrispondenti a 260 5G utilizzando una piastra a sei pozzetti. Sono necessarie cinque volte 10 alla sesta cellule per pozzetto, quindi 30 volte 10 alla sesta cellule per piastra. Sospendere la quantità richiesta a 1,25 volte 10 alla sesta cellule per millilitro in mezzo di coltura marino CD40B.Quindi, integrare frescamente la sospensione cellulare con IL marina quattro a una concentrazione di un'unità per millilitro per la stimolazione, ciclosporina A a una concentrazione di 0,63 microgrammi per millilitro per inibire l'espansione dei linfociti T e 100 micromolar di Beamer CAPTA etanolo. Ora la sospensione cellulare è pronta per la stimolazione con cellule feer. Utilizziamo cellule healer trasfettate con ligando marino CD40 per stimolare la sopravvivenza cellulare, la differenziazione e la proliferazione, poiché la linea cellulare heer può sopravvivere in coltura per diversi mesi.La perdita dell'espressione del legante CD40 marino deve essere esclusa regolarmente mediante fox. Il legante CD40 trasfettato in un'unità di guaritore è una linea cellulare aderente coltivata a 37 gradi con 5% CO2 in un mezzo selettivo integrato con vitamina B a una concentrazione di 0,2 milligrammi per millilitro. Per la selezione, questa linea cellulare epiteliale aderente non deve mai diventare completamente confluenta e deve essere suddivisa due volte alla settimana per separare le cellule aderenti.Aspirare il mezzo di lavaggio una volta con 10 millilitri di PBS. Ruotare delicatamente e aggiungere quattro millilitri di tripsina EDTA in un fiasco da 75 centimetri quadrati. Incubare il fiasco per cinque-dieci minuti a 37 gradi nell'incubatrice.Estrarre nuovamente il matraccio. Usare dei leggeri colpetti per staccare le cellule dalla plastica. Quindi aggiungere delicatamente 10 millilitri di mezzo biotipo, ruotare dolcemente e trasferire le cellule in un tubo da 50 millilitri.Centrifugare le cellule feeder per sette minuti a 1300 giri al minuto, corrispondenti a 260,5 ×g. Sospendere delicatamente le cellule in pellet in 10 millilitri di mezzo wild type per determinare il numero cellulare per il subcultivo; inoculare 2,5 × 10⁶ cellule in 10 millilitri di mezzo di selezione e trasferirle in un’area di 75 centimetri quadrati, quindi incubare le cellule feeder a 37 gradi in presenza di 5% CO₂ per la stimolazione CD40. Prelevare le cellule feeder rimanenti e irradiarle letalmente con 78 Gy per bloccarne la proliferazione.Diluire le cellule feeder nel mezzo wild type con una densità cellulare di 0,2 × 10⁶ cellule per litro e seminare due millilitri per pozzetto in una piastra a sei pozzetti. Lasciare che le cellule diventino nuovamente aderenti prima di utilizzarle come cellule stimolatrici, incubandole per 24 ore a 37 °C e 5% CO₂ per la stimolazione delle cellule con ligando CD40. Verificare al microscopio se le cellule feeder seminate il giorno precedente sono aderenti.Se le cellule feeder sono aderenti, rimuovere con attenzione il SUP natin da ogni pozzetto, quindi trasferire delicatamente quattro millilitri della sospensione cellulare SPOC, precedentemente aggiustata a 1,25 × 10⁶ cellule per millilitro, in ciascun pozzetto per la stimolazione e incubare la piastra a 37 gradi e 5% CO₂. Al quarto giorno, effettuare nuovamente il sottocoltura delle cellule B CD40 murine; per il primo sottocoltura delle cellule B CD40 attivate murine al giorno quattro e per i successivi sottocolturi ogni tre-quattro giorni. Raccogliere delicatamente le cellule aggregate dalla piastra a sei pozzetti risospendendole con una pipetta da 10 millilitri. Riunire le cellule B CD40 murine in un tubo da 50 millilitri e centrifugare le cellule per sette minuti a 1300 giri al minuto (corrispondenti a 260 × g), quindi sostituire completamente il mezzo con il mezzo di lavaggio per cellule B CD40 murine.E per determinare il numero di cellule delle cellule B marine CD40, sospenderemo le cellule B marine CD40 a una densità cellulare di 0,75 × 10⁶ cellule per millilitro in mezzo di coltura per cellule B marine CD40. Successivamente, si integra la sospensione cellulare con nuova IL-4 marina a una concentrazione di 1 unità per millilitro, ciclosporina A a una concentrazione di 0,63 microgrammi per millilitro e 100 micromolar di beam up in etanolo. Naturalmente, le cellule feeder irradiate devono essere nuovamente verificate per l'adesione al microscopio immediatamente prima dell'uso.Se le cellule feeder sono aderenti, rimuovere con attenzione il SUP natin da ciascuna. Successivamente trasferire la sospensione di cellule B marine CD40 preparata poco prima in ciascun pozzetto per la stimolazione. Il subcultivo viene ripetuto in modo identico dopo tre o quattro giorni, due volte alla settimana, fino ad ottenere cellule B attivate CD40 marine altamente pure al giorno 14 della coltura.In questo momento, le cellule B CD40 marine esprimono molecole costimolatorie come CD80, CD86 e molecole MHC di classe I e II, che possono essere verificate da Fox durante la generazione. Le cellule da noi generate in questo momento possono essere utilizzate per condurre ricerche sull'attivazione, differenziazione e funzione delle cellule B, ad esempio per indagare il loro potenziale impiego a scopi immunoterapeutici.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Generazione di Human CD40 delle cellule B attivate

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