Modello murino di CD40-attivazione delle cellule B

Ciao, mi chiamo Tanya Wig e sono una dottoranda e lavoro nel laboratorio di immunologia dei tumori e immunologia dei trapianti presso l'Ospedale Universitario di Colonia. I miei studi si concentrano principalmente sulle cellule B marine attivate da CD 40 e sulla loro capacità di indurre risposte immunitarie in vivo. Originariamente, le cellule B CD 40 umane sono state generate come cellule presentanti l'antigene alternative alle cellule dendritiche.

Queste cellule sono destinate ad essere utilizzate per scopi immunoterapeutici In ambito clinico, le cellule B CD 40 vengono generate sotto segnalazione CD 40 e stimolazione con IL quattro. Secondo questo sistema, possono essere ampliati nell'arco di diverse settimane. Dopo aver ottimizzato la generazione di cellule B CD 40 umane da PBMC nel nostro laboratorio, abbiamo trasferito con successo questo principio ai topi e questo è ciò che voglio mostrarvi oggi.

Partendo dalla milza, generiamo cellule B marine attivate CD 40 entro 14 giorni dalla coltura cellulare. Le fasi principali sono la preparazione delle cellule feeder, quindi utilizziamo una linea cellulare heer trasfettata con ligando CD 40 marino, che è aderente e viene irradiata con 78 gray e placcata su piastre a sei pozzetti. In secondo luogo, iniziamo la coltura marina di CD 40 DB utilizzando citi SPOC appena purificati da topi neri sei, che vengono trattati con interleuchina marina quattro beta macab in etanolo e ciclosporina A. Queste cellule vengono poi trasferite su cellule di feta irradiate su piastre a sei pozzetti.

Questa procedura viene ripetuta ogni tre o quattro giorni fino al giorno 14 della coltura cellulare. Per ottenere cellule B attivate CD 40 marine altamente pure, iniziamo la generazione di cellule B attivate CD 40 marine utilizzando topi LXi con tromba di citazioni SP appena purificate. Per prima cosa laviamo i citi SP mediante Resus sospendendo le cellule in 50 millilitri di terreno di lavaggio marino CD 40 B.

Quindi far girare le celle per sette minuti a 1300 giri/min corrispondenti a 260 5G per determinare il numero di cellule. Risospendere accuratamente i citi in 10 millilitri di terreno di lavaggio marino CD 40 B e infine mescolare le cellule mediante vortex. Quindi determinare il conteggio delle cellule.

Centrifugare la quantità richiesta di citi per sette minuti a 1300 giri/min corrispondenti a 260 5G utilizzando una piastra a sei pozzetti. Sono necessarie da cinque volte 10 a sei celle per pozzetto, quindi da 30 a 10 a sei celle per piastra. Spendere la quantità richiesta in un punto 25 volte 10 delle sei cellule per millilitro nei terreni di coltura marini CD 40 B.

Quindi, integrare nuovamente la sospensione cellulare con IL quattro marino in una concentrazione di un'unità per millilitro per la stimolazione, la ciclosporina A in una concentrazione di oh 0,63 microgrammi per millilitro per inibire la crescita delle cellule T e 100 micromolari di etanolo Beamer CAPTA. Ora la sospensione cellulare è pronta per la stimolazione con cellule feer. Stiamo utilizzando cellule guaritrici trasfettate con ligando CD 40 marino per stimolare la sopravvivenza, la differenziazione e la proliferazione cellulare, poiché la linea cellulare heer può sopravvivere in coltura per diversi mesi.

La perdita dell'espressione delle zampe marine CD 40 deve essere esclusa regolarmente dalla volpe. Il guaritore trasfettato con ligando CD 40 è una linea cellulare di aderenza coltivata a 37 gradi con il 5% di CO2 in terreno di selezione integrato con glassa B in una concentrazione di O 0,2 milligrammi per millilitro. Per la selezione, questa linea cellulare epiteliale aderente non deve mai diventare completamente confluente e deve essere divisa due volte alla settimana per dividere le cellule aderenti.

Aspirare una volta il lavaggio medio con 10 millilitri di PBS. Ruotare delicatamente e aggiungere quattro millilitri di tripsina EDTA in un flacone di 75 centimetri quadrati. Incubare il pallone per cinque-10 minuti a 37 gradi nell'incubatrice.

Estrarre nuovamente il pallone. Picchiettare delicatamente per staccare le celle dalla plastica. Quindi aggiungere 10 millilitri di terreno biotipo, ruotare delicatamente e trasferire le cellule in una provetta da 50 millilitri.

Far girare le cellule di alimentazione per sette minuti a 1300 giri/min corrispondenti a 260 5G. Risospendere attentamente le cellule pellettate in 10 millilitri di terreno di tipo selvatico per determinare la conta cellulare per una sottocoltura RESO ha speso 2,5 volte 10 alle sei cellule in un terreno di selezione da 10 millilitri e trasferirle in un pallone di 75 centimetri quadrati e incubare le cellule di alimentazione a 37 gradi in 5% di CO2 per la stimolazione con CD 40. Prendi il resto delle cellule heer e irradiale letale con grado 78 per impedirne la proliferazione.

Diluire le cellule di alimentazione in terreno wild type con una densità cellulare di O 0,2 volte 10 per sei celle per litro e piantare due millilitri per pozzetto su una piastra a sei pozzetti. Lasciare che le cellule diventino nuovamente aderenti prima di utilizzarle come cellule stimolatrici incubandole per 24 ore a 37 gradi e 5% di CO2 per la stimolazione di citi con ligando vicino a CD 40. Controllare al microscopio se le cellule di alimentazione piastrate un giorno prima sono aderenti.

Se le cellule di alimentazione sono aderenti, rimuovere con cura la natina SUP da ciascun pozzetto, quindi trasferire delicatamente quattro millilitri della sospensione laterale SPOC, che era stata regolata a un punto 25 volte 10 per le sei cellule per millilitro poco prima in ciascun pozzetto per la stimolazione e incubare la piastra a 37 gradi e 5% di CO2 il quarto giorno di sottocoltura di nuovo cellule CD 40 B marine per la prima sottocoltura di CD 40 marino, cellule B attivate il quarto giorno e le successive sottocolture ogni tre o quattro giorni. Raccogliere delicatamente le cellule raggruppate dalla piastra a sei pozzetti spendendo con un tubo da 10 millilitri. Raggruppare le celle marine CD 40 B in un tubo da 50 millilitri e far girare le celle per sette minuti a 1300 giri/min, corrispondenti a 260 5G completamente scambiati con il mezzo di lavaggio marino CD 40 B.

E per determinare la conta cellulare delle cellule B CD 40 marine, sospendiamo le cellule B CD 40 marine a una densità cellulare di oh point 75 volte 10 per le sei cellule per millilitro nel terreno di coltura CD 40 B marino. Inoltre, integrare la sospensione cellulare con IL quattro marino fresco in una concentrazione di un'unità per millilitro, ciclosporina A in una concentrazione di 63 microgrammi per millilitro e fascio di 100 micromolari fino all'etanolo. Naturalmente, le celle di alimentazione irradiate devono essere nuovamente controllate per verificarne l'aderenza al microscopio direttamente prima dell'uso.

Se le celle di alimentazione sono aderenti, rimuovere con cautela la natina SUP da ciascuna. Bene, quindi trasferire la sospensione marina CD 40 B preparata poco prima in ogni pozzetto per la stimolazione. La sottocoltura viene ripetuta in modo identico dopo tre o quattro giorni due volte alla settimana per ottenere cellule B attivate CD 40 marine altamente pure il giorno 14 di coltura.

A questo punto, le cellule B Marine CD 40 esprimono molecole co-stimolatorie come CD 80, CD 86 e molecole MHC più una e due, che possono essere controllate da Fox durante la generazione. Le cellule che abbiamo generato in questo momento possono essere utilizzate per fare ricerca sull'attivazione, la differenziazione e la funzione delle cellule B, ad esempio, per studiare il loro potenziale utilizzo per scopi immunoterapici.