植物细胞壁（木质纤维素生物质）的全面组成分析 第一部分：木质素

测定植物细胞壁中木质素的含量和组分，首先从干燥的植物材料开始，经过一系列提取处理。所得材料仅包含细胞壁，随后对其进行分样以测定木质素含量。将细胞壁材料用乙酰溴进行水解，溶解释放的单体通过紫外分光光度法进行定量，从而确定木质素的组分。

细胞壁材料通过细胞裂解进行水解。溶解的木质素组分随后衍生化为挥发性的三甲基硅烷衍生物，这些衍生物可通过气相色谱结合质谱法进行分离和定量。关于基质多糖组成和纤维素含量的测定，已在另一部题为《植物细胞壁全面组分分析，第二部分：碳水化合物》的视频中展示。

大家好，我是密歇根州立大学大湖生物能源研究中心 Wall 分析实验室的负责人 Marcus Pauley。这位是分析用细胞壁实验室经理 Cliff Foster。我们将为您演示如何测定植物生物质样品的含量与组分。

植物将太阳的光能转化为化学能，例如生物量。植物生物量主要由细胞壁构成，细胞壁是一种复杂的聚合物网络，包裹着所有植物细胞。本文中，我们测定植物细胞壁物质的组成，以评估将这些丰富且可再生的木质素、纤维素X资源转化为生物燃料的潜力。

在另一段题为《植物细胞壁的全面组成分析，第二部分：碳水化合物》的视频中，我们将重点介绍多酚类物质木质素。本文中我们将专注于多糖分析。开始该实验步骤时，向一个2毫升带螺口盖的离心管中加入三个直径5.5毫米的不锈钢珠，以及大约60至70毫克的风干或冷冻干燥植物材料。

可使用研磨与分装机器人eyewall将材料研磨成细粉。eyewall会取走试管并振荡30秒，利用金属球将材料研磨成细粉，随后将已研磨但呈紧密状态的植物粉末松散化，此为一种替代性的低通量非机器人操作步骤。促进逆转录的方法见第二部分：向研磨后的材料中加入1.5 M的70%水合乙醇，充分涡旋混匀，然后在室温下离心。

该处理方法可溶解大多数蛋白质和细胞器，吸走上清液后，向不溶于醇的沉淀中加入等体积的氯仿-甲醇溶液，充分振荡以重新悬浮沉淀，然后离心。氯仿-甲醇可提取疏水性化合物（如脂质），离心后吸走上清液，将沉淀重新悬浮于500微升丙酮中。

将样品置于35摄氏度的气流中蒸发溶剂至干燥，干燥后的样品可在室温下保存，直至进一步处理。为启动样品中淀粉的去除，将沉淀重悬于1.5 mL 0.1摩尔、pH为5的醋酸钠溶液中，盖紧管盖，并在加热块中加热以使淀粉糊化。将悬浮液在冰上冷却后，加入淀粉降解酶混合液，盖紧管盖，充分涡旋混匀，然后将悬浮液过夜孵育。

在37摄氏度的摇床中，旋转摇床可确保充分混匀。过夜孵育后，将样品在100摄氏度的加热块中加热10分钟以终止消化反应。随后离心并弃去上清液，上清液中含有已溶解的淀粉。

将剩余的沉淀物用1.5 mL水各洗涤三次，每次均通过涡旋振荡、离心和倾倒完成，操作方法如前所述。最后，将沉淀物重悬于500 µL丙酮中，并在35 °C下用气流吹干溶剂至完全干燥。所得含有分离细胞壁或去除非纤维素组分的样品即可用于后续分析，可于室温保存。

首先称取1至1.5毫克的制备好的细胞壁材料。该材料可通过手工称量，或如第二部分所示，使用眼壁进行自动化称量。用250微升丙酮冲洗管壁，使细胞壁材料聚集于管底，并在气流下非常温和地蒸发丙酮。

待丙酮完全挥发后，沿容器两壁缓慢加入100微升新配制的25%（体积比）乙酰溴冰醋酸溶液。为防止溅出，轻微的乙酰溴可将木质素聚合物降解为其乙酰化单体。然后盖紧容量瓶，于50摄氏度加热两小时。

再加热一小时，每隔15分钟摇动四次，最后在冰上冷却。待烧瓶冷却至室温后，加入400微升2摩尔氢氧化钠溶液和70微升 freshly prepared 0.5摩尔盐酸羟胺溶液，涡旋混合容量瓶。接下来，用冰醋酸将容量瓶中的溶液准确定容至2毫升刻度线，盖紧瓶盖并反复倒置数次以充分混匀。取200微升含有水解并溶解的单醛的溶液，加入到适用于紫外检测的96孔板中，在酶标仪中于280纳米波长下读取吸光度。至少重复读板三次，并取平均吸光度值，因为颗粒物可能导致吸光度值出现轻微波动。

使用书面方案中提供的公式，结合适当的植物系数，测定微溴化物可溶性木质素（BSL）的百分比。木质素是一种多酚网络结构，主要由三种亚基组成：对羟基苯基、愈创木基和丁香基，用于确定植物材料中木质素的组成。首先，取约2毫克细胞壁材料，转移至带有螺口盖的玻璃试管中，用于细胞裂解。

接下来，准备配制 2.5% 的三氟化硼乙醚络合物和 10% 乙硫醇的二氧六环溶液。由于二氧六环具有高度危险性，切勿将任何样品或设备移出通风橱。务必小心操作，并使用充满氮气的气球向二氧六环试剂瓶中补充因取出液体而减少的体积，以保持氮气氛围。

按以下体积为每份样品配制溶液：175 微升二氧六环、20 微升 ETSH、5 微升 BF3。混匀后，向每份样品中加入 200 微升该溶液。用氮气吹扫小瓶顶空并加盖密封。

立即在100摄氏度下加热样品4小时，每隔一小时轻轻混匀一次。随后将样品置于冰上终止Ace lysis反应，持续5分钟。然后加入150 µL 0.4 M碳酸氢钠以中和反应体系，并涡旋混匀。

为了纯化木质素降解产物，加入1 mL水和0.5 mL乙酸盐，涡旋混匀后静置分相。乙酸乙酯层位于上层，水相在下层。转移150 µL含有木质素组分的上层乙酸乙酯相至2 mL离心管中，注意避免转移水相。

从上层乙酸乙酯相转移后，使用空气浓缩仪蒸发溶剂。加入200 µL丙酮并蒸发。重复丙酮处理两次，以去除多余的水分。

接下来，将木质素组分转化为其易挥发的三甲基硅烷衍生物。向每支试管中加入500 µL乙酸乙酯、20 µL嘌呤和100 µL N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺。在25 °C下孵育2小时。

两小时反应结束后，取100微升反应液转移至GC-MS小瓶中，并加入100微升丙酮。使用配备四极杆质谱仪或火焰离子化检测器的气相色谱仪分析样品。色谱柱及运行参数详情，请参阅随附的书面实验方案。

以下是以杨树木质材料进行木质素分析的一些代表性结果。根据该分析，杨树材料中有22%为多酚类木质素。木质素组分的构成通过气相色谱-质谱联用（GCMS）进行分析。

通过四苯基钴内标物的相对保留时间，或通过S型和G型单体在质谱图中分别具有的299 m/z、269 m/z和239 m/z特征离子峰来鉴定色谱峰。通过将总峰面积设为100%，对木质素组分的组成进行定量分析。组分分析表明，该特定样品主要含有紫丁香基（S单元）。然而，愈创木基（G单元）也较为丰富。

显然，单木质醇单元的含量和组成会因植物组织和物种的不同而有所差异。我们刚刚向您展示了如何测定植物材料中的木质素含量和组成，以用于多糖分析。接下来进入第二部分。

感谢观看，祝您的实验顺利。