Basati sul DNA Fish Identification Specie protocollo

Il sistema di identificazione delle specie ittiche è un metodo semplice, veloce e accurato basato sul DNA per identificare le specie ittiche presenti in un determinato campione. I campioni di pesce vengono trattati con proteinasi K per rilasciare gli acidi nucleici in soluzione. Il DNA genomico dei pesci viene quindi isolato e la PCR amplificata utilizzando primer che si legano alle sequenze presenti in tutti i genomi dei pesci.

I prodotti della PCR vengono quindi digeriti con tre diversi enzimi di restrizione e risolti sul bioanalizzatore Agilent 2100. Le lunghezze dei frammenti prodotte nelle reazioni di digestione possono essere utilizzate per determinare le specie di pesci utilizzando il polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione o il software di corrispondenza dei modelli RFLP. Ciao, sono Rachel Formosa di Agilent Technologies.

Oggi vi mostreremo una procedura per l'identificazione delle specie ittiche basata sul DNA. Questa procedura è un metodo di screening che consente di identificare le specie ittiche presenti in campioni freschi, congelati, macinati, cotti, essiccati o altrimenti lavorati. E questo può essere realizzato in meno di una giornata lavorativa.

Utilizziamo questa procedura per studiare l'autenticità dei prodotti ittici, che è molto importante per l'industria ittica poiché la sostituzione e l'etichettatura errata possono avere conseguenze economiche, ambientali e di sicurezza alimentare significative. Inoltre, può essere particolarmente difficile determinare le specie ittiche mediante l'identificazione visiva e altri metodi tradizionali. Una volta che un pesce è stato lavorato, il test del DNA fornisce un risultato molto più accurato e affidabile.

Quindi iniziamo. Iniziare a preparare i campioni per l'estrazione del DNA posizionando da 10 a 1000 milligrammi di ogni campione di tessuto di pesce crudo o cotto in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri per ogni pesce. Campionare a 220 microlitri di soluzione di proteinasi appena preparata e pipettare su e giù.

Incubare le provette a 65 gradi Celsius per 10 minuti dopo la centrifuga di incubazione per tre-cinque minuti a 14.000 g per pellettare eventuali tessuti non digeriti. Quindi trasferire con cura 150 microlitri di ciascun surnatante in un tubo fresco da 1,5 millilitri, evitando qualsiasi materiale non digerito nella parte inferiore e materiale oleoso presente nella parte superiore. Il surnatante sarà ora utilizzato per l'estrazione del DNA genomico.

Inizia l'estrazione del DNA genomico aggiungendo 500 microlitri di tampone legante l'acido nucleico a ciascun campione. In questo modo il volume totale del campione sale a 650 microlitri. Agitare il campione fino a renderlo omogeneizzato.

Quindi, trasferire ogni campione in una tazza di centrifuga legante il DNA che è stata inserita in una delle provette da due millilitri fornite nel kit. Agganciare il tappo del tubo sulla parte superiore della spin cup. Centrifugare i campioni per un minuto a 14.000 Gs per caricare il DNA sulla matrice della tazza di centrifuga.

Dopo la centrifugazione, rimuovere le coppette centrifughe, scartare il filtrato e riposizionare le coppette nelle provette del recipiente. Aggiungere 500 microlitri di un tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale. Tappare le provette e centrifugare nuovamente dopo la centrifugazione.

Scartare il filtrato e riposizionare nuovamente le coppette centrifughe nei tubi del recipiente. Ora aggiungi 500 microlitri di etanolo all'80%. Tappare il tubo e centrifugare a 14.000 g per un minuto.

Ripetere il lavaggio con etanolo altre due volte dopo il terzo lavaggio in etanolo all'80%, scartare i filtrati. Riposizionare le coppe di centrifuga nei tubi del recipiente e questa volta centrifugare per due minuti per asciugare la matrice di fibre. Trasferire ora le coppette centrifughe in provette di raccolta da 1,5 millilitri.

Aggiungere 100 microlitri di tampone evolutivo a ciascuna spin cup direttamente sulla matrice di fibre all'interno della tazza. Quindi inserire i tappi delle provette di raccolta sulle coppette centrifughe e incubarle a temperatura ambiente per un minuto. Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni alla massima velocità per un minuto.

Quindi, scartare la spin cup e tappare i tubi. Se vengono misurate le concentrazioni di DNA, sono previste concentrazioni che vanno da cinque nanogrammi per microlitro a 500 nanogrammi per microlitro. Il DNA può ora essere conservato a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese per la conservazione a lungo termine, posizionando il DNA a meno 20 o meno 80 gradi Celsius.

Eseguire la PCR utilizzando i primer e i reagenti forniti nel kit di reagenti P-C-R-R-F-L-P. Secondo il protocollo scritto allegato, si consiglia di eseguire ogni campione, incluso il controllo positivo anti no template in duplicato mentre la PCR è in esecuzione. Preparare miscele master di enzimi di restrizione per le digestioni con DTE, E, uno, HAE, tre e NL tre, combinando i seguenti componenti, nell'ordine, 1,5 microlitri di acqua distillata sterile, 0,5 microlitri di 10 x tampone enzimatico e 0,5 microlitri di 10 x enzima.

Preparare una quantità sufficiente per tutti i campioni più un volume di reazione, l'eccesso di una miscela di tre reagenti. Quindi distribuire 2,5 microlitri in ciascuna provetta di reazione etichettata con il campione e il nome dell'enzima. Una volta completata la PCR, rimuovere i campioni dal termociclatore e metterli sul ghiaccio.

Aggiungere 2,5 microlitri di ciascun prodotto PCR a ciascuna delle tre provette di digestione di restrizione per quella reazione. DDE uno, HAE, tre e NLA tre. Prossimo vortice.

Centrifugare brevemente e incubare le digestioni a 37 gradi Celsius per due ore. Se più conveniente, le digestioni possono anche essere incubate durante la notte. Dopo la digestione, incubare le reazioni a 65 gradi Celsius per 15 minuti.

Quindi aggiungere un microlitro di EDTA da 60 millimolari a ciascuna provetta per terminare la reazione e il vortice. Utilizzando il kit di reagenti del bioanalizzatore Agilent, preparare e caricare il digestato di restrizione nei pozzetti del chip di DNA A secondo la guida del kit. Per ogni campione, tutti e tre i digest devono essere caricati sullo stesso chip.

Quindi vorticare il truciolo e caricarlo nella macchina. Al termine dell'esecuzione, accedere al contesto del test e selezionare la scheda di riepilogo dei chip. Nel campo del nome del campione, inserisci un nome del campione per tutti i 12 pozzetti del chip per identificare le specie ittiche per i campioni di DNA del test.

Avviare il programma di decodifica RFLP facendo clic su file. Quindi apri il file XAD. Si aprirà la finestra di dialogo aperta.

Ora seleziona il file XAD per il chip di DNA utilizzato. E fare clic su Apri per visualizzare un elenco dei campioni caricati sul chip. Selezionare i tre digest corrispondenti al primo campione di DNA.

Nella colonna enzimatica, specificare gli enzimi di restrizione utilizzati nel campo etichettato come altezza minima del picco come percentuale del marcatore inferiore. Il valore predefinito è 10%se necessario. Questo valore può essere abbassato per identificare piccoli picchi che sono stati mancati o aumentato per scartare i picchi risultanti da un rumore non specifico nell'elettroferogramma.

Dopo aver apportato le modifiche al valore dell'altezza di picco minima, fare clic su Reintegra. Ora fai clic su calc nella parte inferiore della finestra di dialogo. I dati sulla lunghezza del frammento ottenuti dall'esecuzione del bioanalizzatore popoleranno i campi del software.

Successivamente, nell'elenco a discesa dei punteggi nell'angolo in alto a sinistra dello schermo, seleziona i dadi. Se il campione di pesce è costituito da una singola specie ittica o da una miscela, se il campione può essere costituito da una miscela, la tabella nella parte inferiore della schermata è indicata con l'etichetta Elenco dei punteggi combinati. Le migliori specie corrispondono in base ai risultati di tutte e tre le reazioni di digestione.

Le corrispondenze perfette con un punteggio di uno sono evidenziate in verde. Le corrispondenze vicine sono evidenziate in giallo nella parte superiore dello schermo. Il valore di taglio inferiore indica la dimensione minima del frammento utilizzata nell'analisi e il valore di tolleranza di corrispondenza determina la distanza di lunghezza di un frammento dal frammento previsto per essere considerato una corrispondenza.

I valori mostrati sono le impostazioni predefinite e possono essere regolati. Ripetere questi passaggi per l'analisi dei campioni di DNA rimanenti sulla punta. I campioni di DNA di quattro diverse specie di pesci sono stati isolati, amplificati e digeriti utilizzando il metodo descritto in questo video.

Un gel bioanalizzatore che mostra i campioni di digest di restrizione è mostrato qui utilizzando il bioanalizzatore Agilent e il decodificatore RFLP. I modelli di piegatura software vengono utilizzati per identificare il pesce qui. Il primo campione è correttamente identificato come trota, il secondo come tonno, il terzo come terreno roccioso.

E l'ultimo campione come cod. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire l'identificazione delle specie ittiche basata sul DNA utilizzando il metodo P-C-R-R-F-L-P di agilent. Quando si esegue questa procedura, è importante evitare la contaminazione incrociata dei campioni poiché il metodo è molto sensibile.

Quindi questo è tutto. Ora sai come identificare in modo rapido, semplice e accurato le specie ittiche presenti nei tuoi campioni. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.