C. elegans Dissezione del blastomero: un metodo per rimuovere il guscio dell'uovo e dissociare le cellule embrionali

- Per questa dissezione, utilizzare due micropipette: una con un'apertura all'incirca della stessa larghezza di un uovo e una larga il doppio, e una serie di soluzioni organizzate in pozzetti per facilitare il rapido trasferimento tra di loro.

Innanzitutto, metti gli ermafroditi adulti in una soluzione di sale d'uovo, che è osmoticamente bilanciata per evitare che gli embrioni scoppino. Taglia i vermi a metà per rilasciare gli embrioni in via di sviluppo.

Quindi, identifica gli embrioni in fase di due cellule. Queste cellule sono i blastomeri formati dalla divisione dell'ovulo fecondato. Utilizzare la micropipetta con l'apertura più grande per trasferire un embrione in una soluzione di ipoclorito, candeggina, che inizierà a rompere il guscio d'uovo protettivo.

Dopo soli 40-55 secondi, trasferisci l'embrione nel terreno di coltura di Shelton, o SGM. Lavare brevemente ogni embrione in due pozzetti di SGM per rimuovere tutte le tracce di candeggina prima di metterli in un terzo pozzetto.

Ora, usa la micropipetta più piccola per pipettare ripetutamente l'embrione fornendo la forza meccanica per rimuovere il guscio d'uovo ed esporre i blastomeri. Continuare delicatamente a pipettare l'embrione per separare le singole cellule del blastomero. Nel protocollo seguente, vedremo questa tecnica in azione.

- Tenere ciascuna estremità di un microcapillare a una capacità di 10 microlitri con la mano destra e sinistra. Tirare il microcapillare verso entrambe le estremità per applicare la tensione e portare il centro del capillare sopra un bruciatore per creare due capillari tirati a mano.

Sotto il microscopio da dissezione, tagliare le punte dei capillari tirati a mano con una pinza. Rendere le due dimensioni di apertura della punta circa due volte e una volta la lunghezza dell'asse corto degli embrioni di C. elegans rispettivamente per il trasferimento dell'embrione e la rimozione del guscio d'uovo.

Collegare il capillare estratto in un apparecchio di pipettaggio orale. Pipettare 45 microlitri di soluzione di sale d'uovo su un pozzetto di un vetrino a più pozzetti.

Metti da 5 a 10 C. elegans adulti sul pozzo. Per ottenere embrioni precoci di C. elegans, tagliare gli adulti in pezzi posizionando due aghi a destra e a sinistra del corpo di C. elegans e facendo scorrere gli aghi l'uno sull'altro.

Pipettare 45 microlitri di soluzione di ipoclorito in un pozzetto accanto al pozzetto contenente la soluzione di sale d'uovo e pipettare 45 microlitri di terreno di coltura di Shelton nei tre pozzetti successivi. Trasferire gli embrioni allo stadio di una cellula e allo stadio iniziale di due cellule nella soluzione di ipocorite con la pipetta orale con apertura di dimensioni maggiori e attendere da 40 a 55 secondi.

Lavare gli embrioni trasferendoli nei tre pozzetti successivi con il terreno di coltura di Shelton con 1 o 2 secondi in ciascuno dei primi due pozzetti. Utilizzando il capillare disegnato a mano con un'apertura di dimensioni più piccole, ripetere attentamente il pipettaggio dell'embrione per la rimozione del guscio d'uovo.

Successivamente, pipettare continuamente con il capillare disegnato a mano per separare i blastomeri embrionali a due cellule.

- Dopo la rimozione del guscio d'uovo, ridurre al minimo la forza nel pipettare gli embrioni su e giù per evitare lo scoppio.