Raccolta di sottopopolazioni leucemiche: un metodo per la separazione spaziale di sottopopolazioni di cellule leucemiche dalla co-coltura 2D

- Quando le cellule leucemiche vengono co-coltivate con cellule stromali mesenchimali, interagiscono con le cellule stromali e formano tre sottopopolazioni. Cellule sospese che fluttuano liberamente, cellule phase-bright aderenti alla superficie del monostrato mesenchimale e cellule phase-dim sotto il monostrato mesenchimale. Per separare ogni sottopopolazione, prelevare una piastra di coltura tissutale con un monostrato di cellule stromali mesenchimali.

Seminare le cellule leucemiche presenti nei terreni di coltura specifici per il tumore sul monostrato e incubare la piastra per la durata desiderata. Successivamente, raccogliere le cellule tumorali in sospensione pipettando le cellule che fluttuano liberamente in una provetta separata. Ora, aggiungere il terreno fresco alla piastra e pipettare energicamente per rimuovere le cellule tumorali lucide dalla superficie del monostrato mesenchimale.

Raccogliere queste cellule pipettandole in una provetta separata. Aggiungere la tripsina alla piastra per rimuovere le cellule mesenchimali aderenti. Aggiungi siero fetale bovino, o FBS, per fermare l'azione della tripsina e rompere gli aggregati cellulari. Ora, raccogli le celle a attenuazione di fase in una provetta. Centrifugare singolarmente tutte e tre le provette contenenti diverse sottopopolazioni cellulari e risospendere il pellet in un terreno fresco per ulteriori analisi. Nel seguente protocollo, isoleremo cellule leucemiche in sospensione, phase-bright e phase-dim da co-coltura 2D.

- Per raccogliere la sottopopolazione tumorale in sospensione, aspirare il terreno dalla piastra di co-coltura di cellule leucemiche e utilizzare lo stesso terreno per sciacquare delicatamente la piastra una volta. Quindi, trasferire la sottopopolazione di cellule leucemiche in sospensione galleggiante in una provetta conica da 15 millilitri. Per raccogliere la sottopopolazione tumorale in fase brillante, aggiungere 10 millilitri di terreno fresco sulla piastra di co-coltura

e risciacquare circa cinque volte con sufficiente vigore, per rimuovere le cellule leucemiche aderenti senza rimuovere il monostrato di cellule aderenti. Quindi, trasferire la sottopopolazione phase-bright nel proprio tubo conico da 15 millilitri. Per raccogliere la sottopopolazione tumorale a fase attenuante, rimuovere il terreno rimanente con un risciacquo PBS da un millilitro e staccare le cellule con tre millilitri di tripsina a 37 gradi Celsius.

Dopo cinque minuti, picchiettare delicatamente i lati della piastra per rimuovere le cellule aderenti, seguito dall'aggiunta di un millilitro di FBS per fermare la reazione enzimatica. Quindi, sciacquare il siero da tre a cinque volte per rompere eventuali aggregati cellulari di grandi dimensioni e trasferire la sottopopolazione di fase attenuata non purificata in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Quando tutte le sottopopolazioni sono state raccolte, far girare le celle e risospendere ciascuno dei pellet in un millilitro di terreno preriscaldato.

• Leukemic cells - Abnormal cells that overwhelms healthy blood cells and control their function.
• Mesenchymal Stromal Cells - Multipotent cells that support cell growth.
• Subpopulation - Portion of a population distinguished by characteristic behaviors.
• Fetal Bovine Serum (FBS) - Common supplement used in cell culture.
• Trypsin - Enzyme used to break down proteins and detach cells in culture.

• Introduce Leukemic cells to Mesenchymal Stromal Cells - Illustrate the interaction (e.g., Co-culture).
• Outline Cell Subpopulations - Explain different cell types in the co-culture (e.g., Suspended, Adherent).
• Explain Cell Separation Techniques - Brief on the use of medium, trypsin, pipetting (e.g., Co-culture experiment).

• What is co-culture and how do leukemic cells interact with mesenchymal stromal cells?
• What are the subpopulations of cells in a co-culture?
• How are different cell subpopulations separated in a co-culture?

• Describe Practical Application - Co-culture experiments in studying cancer (e.g., Leukemia research).
• Industry Impact - Advances in healthcare and drug development (e.g., Cancer treatments).
• Societal Importance - Role in disease understanding and prevention (e.g., Health awareness).
• Link to Scientific Advancement - Contribution towards biomedical sciences.