Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di eseguire un test accurato su campioni di midollo osseo da pazienti con leucemia mieloide acuta per la malattia residua misurabile, inclusa la quantificazione delle cellule staminali leucemiche. Questo metodo può fornire una valutazione accurata della malattia residua misurabile in campioni di midollo osseo di pazienti con leucemia mieloide acuta. Il vantaggio principale di questo approccio è che un attento seguito del protocollo produce risultati altamente riproducibili e di alta qualità.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono al processo decisionale clinico in quanto può essere utilizzata come lettura della risposta dei pazienti al trattamento. A dimostrare le procedure saranno Jeroen Janssen, ematologo, Gerrit Sijm, tecnico del laboratorio di ematologia diagnostica e Jennifer Scheick e Sander Snel, tecnici del team MRD. Con il paziente in posizione di decubito laterale, contrassegnare la spina iliaca posteriore superiore con una penna e disinfettare la pelle dell'area bioptica prevista con clorexidina in etanolo allo 0,5-1% con un movimento circolare verso l'esterno.

Dopo aver somministrato un anestetico locale, prendi un ago calibro 15 da 2,8 pollici con l'estremità prossimale nel palmo e l'indice contro il lato dell'asta metallica dell'ago vicino alla punta per il controllo. Esercitando una pressione delicata ma decisa, introdurre l'ago con un rapido movimento pronatore alternato e supinato attraverso la pelle anestetizzata verso la spina iliaca. Quando l'ago entra in contatto con la spina iliaca posteriore, rimuovere la stilette e collegare una siringa vuota da 10 millilitri all'ago.

Estrarre delicatamente lo stantuffo per creare una pressione negativa all'interno della siringa fino a quando non sono stati raccolti fino a 10 millilitri di spicole del midollo osseo. Non assumere più di 10 mil di midollo osseo per aspirato per evitare l'emodiluizione. Togli la siringa e rimetti la stilette sull'ago.

Quindi, espellere circa due millilitri di midollo in un vetro dell'orologio e assicurarsi che venga prelevato un campione sufficiente per essere iniettato in una provetta da otto millilitri rivestita di eparina e capovolgere immediatamente la provetta. Per prevenire la coagulazione, è importante investire il tubo contenente anticoagulante non appena viene aggiunto il midollo osseo. Per una valutazione morfologica ottimale, utilizzare una spatola di plastica per trasferire le spicole dall'aspirato nel vetro dell'orologio su un vetrino e far scorrere con cautela un altro vetrino sulla parte superiore del midollo.

Dopo l'essiccazione, colorare le spicole con May-Grunwald Giemsa per l'analisi al microscopio ottico. Posizionare la provetta per il midollo osseo in un supporto di plastica e posizionare il supporto in un contenitore di plastica con una confezione di gel a temperatura ambiente e un modulo di richiesta compilato. Prima di analizzare il midollo osseo mediante citometria a flusso, avviare il citometro a flusso e aprire il software di analisi della citometria a flusso per creare un nuovo esperimento con un diagramma a punti a dispersione diretta rispetto a quello a dispersione laterale.

Per valutare le dimensioni e la granularità delle cellule, caricare le cellule del sangue periferico lisate non marcate da un donatore sano e selezionare la funzione Acquisisci cellule. Gate dei linfociti e regolazione delle tensioni di dispersione diretta e laterale per raggiungere i valori target medi appropriati per la popolazione di cellule gated. Quindi, acquisisci i dati per almeno 10.000 eventi.

Per impostare le tensioni del tubo del fotomoltiplicatore del canale di florescenza target, utilizzare prima le particelle di calibrazione della perlina arcobaleno a otto picchi secondo le istruzioni del produttore per acquisire 10.000 eventi a una bassa portata. Gate le perline singoletto nel grafico a punti di dispersione in avanti rispetto a quello laterale, seguito dal gating del 7° picco nel grafico a punti FITC-PE. Gate le popolazioni di perline risultanti per ciascun fluoroforo.

Continuare l'acquisizione della sospensione a sfere arcobaleno a otto picchi e regolare e mettere a punto le tensioni PMT in tutti i canali di fluorescenza per raggiungere i valori MFI target secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare Registra per raccogliere i dati di circa 2.000 eventi e controllare l'MFI per le perle del 7° picco. Successivamente, aggiungere un volume sufficiente di ciascun anticorpo sperimentale coniugato al fluorocromo per colorare le perle nei corrispondenti tubi di florescenza meno un controllo e agitare accuratamente i tubi.

Creare un nuovo esperimento in bianco con gli stessi parametri di compensazione, facendo attenzione che la soglia di dispersione diretta sia impostata su 5.000 e che i valori di compensazione di tutti i fluorocromi siano pari a zero. Per creare i controlli di compensazione, selezionare la funzione Crea controllo di compensazione e caricare il tubo di controllo non colorato. Regolare il gate P1 attorno alla popolazione di perline singoletto e verificare che il gate P1 contenga solo perline singoletto.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sul gate P1 e selezionare Applica a tutti i controlli di compensazione. Quindi, registrare i dati per tutti i singoli tubi di florescenza marcati confermando che il gate P2 comprende la popolazione positiva su ciascun istogramma di florescenza. Per colorare le cellule per l'analisi citofluorimetrica, trasportare il midollo osseo in laboratorio, controllare il modulo di richiesta per verificare il numero di studio del paziente e la data di nascita e determinare cosa deve essere colorato.

Per la MRD, utilizziamo un pannello colorante composto da quattro tubi. Qui dimostriamo la colorazione del pannello LSC che consiste in un tubo. Dopo la conta cellulare, trasferire il volume appropriato di midollo osseo in una nuova provetta da 15 millilitri.

Aggiungere un tampone di lisi a 10 volte il volume cellulare sperimentale per lisare i globuli rossi. Capovolgere la provetta per mescolare e incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine del periodo di lisi, pellettare le celle mediante centrifugazione.

Risospendere le celle in 15 millilitri di tampone di lavaggio a temperatura ambiente e raccogliere nuovamente il pellet di celle mediante centrifugazione. Nel frattempo, pipettare la quantità appropriata di soluzione per cocktail di anticorpi in provette FACS da cinque millilitri. Qui è mostrato il pannello per il tubo delle cellule staminali.

Risospendere il pellet nel tampone di lavaggio e aggiungere la sospensione della cellula alla provetta FACS contenente la soluzione cocktail di anticorpi monoclonali per un'incubazione di 15 minuti al buio. Quindi, lavare le celle nel tampone di lavaggio e pellettare le celle mediante centrifugazione. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet in 400 microlitri di tampone di lavaggio fresco.

Per analizzare le cellule staminali leucemiche, aggiungere quattro microlitri di perle bianche alla sospensione cellulare che viene colorata con il cocktail di anticorpi delle cellule staminali. Quindi, leggere i campioni utilizzando i parametri precedentemente impostati acquisendo almeno quattro volte da 10 a 6 eventi dai campioni di pazienti sperimentali. Per identificare l'immunofenotipo associato alla leucemia osservato in circa il 90% dei pazienti con leucemia mieloide acuta, è fondamentale che le paratoie siano impostate in modo appropriato come illustrato.

Qui, vengono mostrati esempi di dati di singoli pazienti che presentano diversi tipi di aberranza sulle cellule primitive CD34-positive. In questi grafici, si può osservare un paziente che rimane in remissione completa e un paziente che ha avuto una recidiva dopo aver avuto risultati positivi misurabili di malattia residua dopo il secondo ciclo di terapia di induzione, sottolineando la necessità di un'accurata impostazione del cancello prima dell'analisi del campione. L'identificazione e la quantificazione delle LSC richiede un'ulteriore analisi delle aberranze, in particolare sulle cellule blastiche CD34-positive CD38-negative, come mostrato in questi grafici.

Durante l'esecuzione di questo protocollo, è molto importante disporre di personale specializzato e di supporto per il campionamento del midollo osseo, il trasporto, il lavoro sperimentale e le fasi di analisi di questa procedura. Questa procedura può essere utilizzata anche per eseguire analisi citogenetiche e molecolari per rispondere a ulteriori domande sulla correlazione tra specifiche popolazioni cellulari e aberranze molecolari di interesse, o per affinare il gruppo di rischio di un paziente per prevedere l'esito clinico. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ematologia per esplorare la malattia residua nei pazienti con LMA dopo il trattamento.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identifichiamo e quantifichiamo accuratamente la malattia residua utilizzando la citometria a flusso, inclusa la raccolta e il trasporto di campioni di midollo osseo di pazienti con LMA.