Name: Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Impara un protocollo accurato per analizzare campioni di midollo osseo nella leucemia mieloide acuta, misurando la malattia residua e le cellule staminali leucemiche tramite citometria a flusso.

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Questa ricerca è stata sostenuta da Dutch Cancer Society (ALPE 2013-6371) ed Egbers foundation per VONK. Ringraziamo il gruppo di lavoro di AML-MRD olandese per la collaborazione e discussioni fruttuose per il miglioramento continuo e la standardizzazione di AML-MRD.

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<li>Ravandi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+minimal+residual+disease+assessed+by+multiparameter+flow+cytometry+is+highly+prognostic+in+younger+patients+with+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia.</a> Cancer. 123 (3), 426-435 (2017).</li>
<li>Hourigan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurable+residual+disease+testing+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 31 (7), 1482-1490 (2017).</li>
</ol>

I cocktail di anticorpi utilizzati per la validazione del tubo delle cellule staminali in diversi istituti indipendenti sono state gentilmente concesse da BD. Gli autori non hanno nulla a rivelare in relazione a questo manoscritto.

Dati ampio sono disponibili che mostrano la prova per la positività MRD essendo associate con la sopravvivenza difficile, e quindi valutazione MRD può migliorare il risultato paziente fornendo informazioni prognostiche supplementari su cui si possono prendere decisioni cliniche. Quindi, un metodo coerenza e armonizzato per valutazione immuno-fenotipica della MRD è indispensabile migliorare in ultima analisi, la terapia del paziente. Questo è importante anche quando si confrontano gli studi clinici attraverso diversi siti clinici, e può in definitiva aiuto in clinica decisione fare e servire come un endpoint clinico surrogato per la sopravvivenza globale. La nozione che solidi orientamenti sono garantiti per le misure precise e coerenti di MRD ha portato a un'azione concertata della rete europea di leucemia (ELN) indicazioni di progettazione all'avanguardia. Questo documento completo sarà pubblicato tardo-2017 e sarà fondamentale per molti gruppi di studio e laboratori muovendo in avanti.
Fasi critiche all'interno del protocollo
Un aspetto importante e spesso trascurato dell'analisi MRD è l'impatto della qualità del campione sulla determinazione accurata di MRD. Questo è più evidente quando il materiale deve essere trasportata ad altri istituti in sperimentazioni cliniche, dati le considerazioni operative aggiuntive che devono essere prese in considerazione in questa impostazione. Per ridurre il rischio di confondere il paziente informazioni e consegna tempestiva dell'amministrazione adeguata campioni è cruciale. Ancora una volta, in questa fase del trasporto le forme corrette e/o importazione in sistemi elettronici ospedalieri con chiare assegnazioni dell'analisi richiesta è necessaria. Notando la stage presso terapia di campionamento MRD è anche cruciale poiché esso può essere rilevante per risoluzione clinica (ad esempio dopo il secondo corso della terapia) e pertanto dovrebbe essere chiaramente definito. L'uso di dati fittizi (come per esempio gennaio 1 all'anno di nascita) aumenta il rischio di confondere i pazienti o le analisi. Se richiesto dalla legge, un modo alternativo di anonimo di identificazione deve essere utilizzato.
Tutti gli esemplari per immunophenotyping dovrebbero essere trattati preferenzialmente entro 24 h dalla raccolta. Anche se non raccomandabile, midollo osseo e campioni di sangue periferici ancora possono elaborati e analizzati fino a 72 h, conservato a temperatura ambiente. Inoltre, tutte le manipolazioni con il materiale migliore possono essere eseguite in condizioni di sterilità, così ulteriore crioconservazione delle cellule in biobanche (locale) rimane rilevante: molti studi clinici hanno ulteriori analisi per analizzare ulteriormente le cellule di leucemia con rispetto alle caratteristiche molecolari, immuno-fenotipica e funzionale deve essere eseguita in una fase successiva. Tuttavia dettagli di biobanking non rientrano nell'ambito di questo manoscritto.
Utilizzando MRD come strumento diagnostico implica che ha bisogno di un laboratorio accreditato, non solo per citometria a flusso, ma anche per quanto riguarda il controllo di qualità di valutazione MRD. Ciò può richiedere la distribuzione di campioni ai laboratori di riferimento specifici o (ri) analisi dei file di flusso con le misurazioni di MRD da squadre di riferimento.
Questo articolo viene descritto le azioni più importanti da midollo osseo aspirato insieme alla determinazione di MRD in campioni clinici - che richiedono un intero team di esperti con specifici compiti, responsabilità e con una comunicazione frequente per una efficace caratterizzazione e analisi. Poiché ogni attività è determinante per la procedura, è consigliabile avere suono logistica tra cui protocolli ad ogni laboratorio e sufficiente personale di backup che sono stato addestrato in modo specifico per l'attività. Inoltre, poiché ci sono alcuni passaggi relativamente soggettive in parte delle procedure (soprattutto la identificazione dei marcatori aberranti LAIP e LSC), è essenziale avere discussioni circa il risultato finale da parte del team, e hanno la relazione finale autorizzata da un team di autorità di vigilanza. Gli sforzi attuali stanno perseguendo lo sviluppo del software di computer che vi aiuterà a standardizzare l'analisi MRD (LAIP e LSC).
Modificazione e risoluzione dei problemi
Ogni laboratorio può avere una propria serie di anticorpi che può essere utilizzato per definire le sottopopolazioni differenti pur avendo un backbone standardizzato dei marcatori è essenziale per ottenere risultati comparabili, come indicato nelle linee guida ELN d'avanguardia per documento misure MRD di cui sopra. Indipendentemente degli indicatori scelti ci sono alcuni problemi che possono rendere difficile l'analisi dei risultati e devono essere prese in considerazione.
Limiti della tecnica
L'identificazione di espressione aberrante marcatore LAIP e LSC è in primo luogo valutato alla diagnosi e monitorato nel tempo (durante e dopo la terapia) per accurata caratterizzazione del fenotipo MRD. Mentre oltre il 95% dei pazienti può essere valutato tramite LAIP o LSC (o entrambi), ancora alcuni pazienti hanno nessun LAIPs definito o no CD34 + CD38-LSCs presentano con CD34 negativi blasti o avere un campione di diagnosi mancante. In questi casi, vale ancora la pena di cercare di misurare MRD con un pannello di anticorpi più ampi in quanto il numero di celle disponibili permette e quindi seleziona il più affidabile (dando la distinzione più forte delle cellule leucemiche) LAIP. Considerando che una percentuale di pazienti che recidivano in definitiva non assomigliano completamente il immunophenotype di diagnosi, a causa dell'eterogeneità della malattia AML, un vasto pannello degli anticorpi alle MRD di misura è consigliabile comunque. Questi spostamenti di immunophenotypic includono le cellule di scoppio e LSCs e sono stati indicati per verificarsi durante terapia16 e la malattia misurabile può basarsi su queste popolazioni prossime cosiddette. In questo momento tuttavia, esso è non stato determinato se tutte le sottopopolazioni di immunophenotypic porterà alla ricaduta di malattia, ed è pertanto non comune pratica di segnalare MRD su misura-terapia basato su queste cellule negli studi clinici. È importante notare che il rischio di perdere LSC a causa di spostamenti di popolazione è ridotta tramite l'approccio di un tubo in cui i più importanti marcatori definizione aberrancy sono in un unico flusso cytometry (PE) canale14.
Significato per quanto riguarda i metodi esistenti
Il metodo descritto in questo protocollo si basa sulla definizione di uno o più LAIPs, le celle che sono seguite durante la terapia. Uno svantaggio di questo metodo è che è stato recentemente dimostrato che LAIP possono cambiare durante la terapia. In questo modo alcune popolazioni prossime con differenti marcatori aberranti possono essere mancate. Per ovviare a questo, sarebbe meglio misurare tutti i marcatori aberranti anziché solo quelli che si trovano al momento della diagnosi. Quindi questo sarebbe simile all'approccio "diverso dal normale" che viene utilizzato da diversi laboratori17.
Applicazioni future
Recentemente, MRD ha ricevuto attenzione supplementare per sperimentazione clinica romanzo di progettazione. In epoca di opzioni di trattamento specializzato e terapia farmacologica mirata, l'uso di MRD come misura di esito ridurrà il tempo necessario per stabilire l'efficacia clinica di nuovi trattamenti, in ultima analisi, permettendo più veloce introduzione di urgente bisogno terapeutico opzioni in clinica. L'importanza della logistica appropriata ed esecuzione pratica di una valutazione di MRD armonizzata sono cruciali per il futuro successo di trattamento di AML come la FDA sta attualmente esaminando la possibilità di usando MRD come endpoint surrogato invece di sopravvivenza globale misura18.

Leucemia mieloide acuta (AML) è che un tumore maligno del midollo osseo caratterizzata da difetti nel programma di maturazione, con anomala proliferazione e accumulo di cellule progenitrici mieloidi, inibizione di ematopoiesi normale e in definitiva insufficienza del midollo osseo . La malattia è altamente eterogenea per quanto riguarda la morfologia, immunofenotipo, citogenetica, molecolare aberrazioni e firme di espressione genica, nonché alla risposta al trattamento e trattamento risultato1,2. Gestione attuale comprende la chemioterapia di induzione con l'obiettivo di raggiungere la remissione completa (CR), seguita da post-remissione trattamento, che è in gran parte guidato dai risultati di molecolare, citogenetica e immunophenotypic studi e consiste di uno diversi corsi di chemioterapia complementare o di trapianto di cellule staminali (autologo o allogenico)3. Nonostante i tassi di remissione alta dopo la chemioterapia intensa fino al 90%, sopravvivenza a 5 anni negli adulti è solo circa 30% - 40%, principalmente dovuto lo sviluppo di recidive che sono comunemente resistenti alla chemioterapia e quindi molto difficili da trattare. Risultato in bambini è meglio, anche se circa un terzo anche la ricaduta. Pertanto, l'individuazione tempestiva della ricaduta imminente riempirà un'esigenza medica insoddisfatta e può guidare la terapia post-remissione4.
Malattia residua dopo terapia può riflettere la somma di tutte le diagnosi e meccanismi/fattori di resistenza post-diagnosi; quindi la sua misurazione può essere prognostici e strumentale per guidare il trattamento. La possibilità della malattia residua di deﬁnire (precedentemente chiamata malattia minima residua e ora indicata come misurabile malattia residua o MRD) lontano sotto il criterio morfologico delle cellule di scoppio 5% sta cambiando il panorama del rischio classiﬁcazione. Attualmente i due metodi utilizzati principalmente per rilevare MRD sono flusso cytometry-molecolari basati e, quest'ultima viene valutata da d'inversione di transcriptase PCR (RT-qPCR)5 o, anche se in una fase precoce, di prossima generazione sequenziamento (NGS). Molti studi negli adulti e nei bambini già dimostrato che vari approcci MRD forniscano informazioni prognostiche forte in AML sia dopo induzione e consolidamento terapia6,7e una nuova definizione di malattia onere ( superiore a CR morfologica) emerge ora8. Ciò suggerisce MRD valutata dal flusso e/o tecniche molecolari dovrebbero diventare e in realtà stanno già diventando, standard in ogni studio clinico in AML.
Questo manoscritto viene descritto la procedura di cytometry di flusso dettagliato per ottenere una caratterizzazione di immunophenotypic accurati e riproducibili di MRD nei campioni di midollo osseo, tra cui il campionamento del midollo osseo e l'elaborazione di procedure che precedono la citometria a flusso. La disponibilità di campioni di midollo osseo di buona qualità alla diagnosi ed al follow-up è fondamentale per il successo di questa misura in siti clinici e studi clinici. In realtà, queste considerazioni pre-analitiche sono anche degli approcci MRD di vitale importanza per molecolare (PCR e NGS). Per la caratterizzazione di immunophenotypic di MRD, aberrante espressi marcatori sono combinati con normale mieloide e marcatori di cellule progenitrici, per identificare un immunophenotype leucemia-collegato (LAIP)9. MRD misura la risultante di molti fattori che influenzano la risposta alla terapia, quali leucemia intrinseca o acquisita farmacoresistenza, farmacodinamica e cinetica di terapia, sorveglianza immune e di conformità. Di conseguenza, MRD è un parametro di prognostico post-diagnosi molto forte connesso con risultato clinico quando Dicotomizzate su un livello di cut-off determinato mediante analisi di caratteristica operativa ricevente (ROC). Per nostra coorte AML adulto di HOVON 42a studio, il livello di cut-off è fissato a 0,1% di cellule bianche del sangue LAIP positivo cellule/totale. Utilizzando questo criterio per determinare lo status negativo vs positivo MRD, un gruppo di pazienti possa essere identificato che hanno un'incidenza di recidive significativamente peggiore, la sopravvivenza ricaduta-libera e generale6. Inoltre, descriviamo la misura delle cellule di leucemia immaturi, resistente alla droga con le caratteristiche delle cellule staminali (cellule staminali CD34 + CD38-leucemia o LSC), che offre un forte predittore di outcome del paziente10. Insieme LAIP e LSC si avvicina forma l'approccio MRD cytometric di flusso. L'approccio LAIP è adatto per circa il 90% dei pazienti, mentre l'approccio LSC può essere applicato in circa l'80% dei pazienti. Insieme sopra 95% dei pazienti possono essere valutati per un parametro o entrambi.
Infine, questa pubblicazione fornisce una descrizione dettagliata di operativa per valutare MRD tramite flusso cytometry. Questo include: 1) armonizzazione e/o standardizzazione delle procedure di prelievo di midollo osseo, guida trasporto 2) esempio 3) Descrizione dettagliata del rilevamento delle cellule leucemiche con FACS usando diversi pannelli di anticorpo, inclusi gli approcci di tubo singola cella a caratterizzare la LSC, 4) set-up della FACS macchine per misure standardizzate, 5) programmi analitici per misurazioni MRD e 6) programmi di analisi per il rilevamento di LSC.
Miriamo a mostrare tutte le sfaccettature della procedura tra cui la preparazione del campione, dal momento che è raramente discusso mentre è una questione importante per la qualità del risultato finale. Biopsia e aspirazione del midollo osseo sono procedure cliniche utilizzate per valutare le cellule ematopoietiche all'interno del midollo osseo. Questi vengono eseguiti insieme ad un esame emocromocitometrico completo (CBC) e sbavatura di anima. Il metodo ottimale per l'aspirazione del midollo osseo è fondamentale per la diagnosi esatta e follow-up per la misura di MRD. Inoltre, un successo il midollo osseo aspirato dovrebbe contenere abbastanza cellule per eseguire l'analisi del flusso LAIP e LSC (cellule vitali almeno 10 milioni). Qui, descriviamo il metodo per eseguire un'aspirazione del midollo osseo e fornire linee guida, che dovrebbero provocare adeguata cella campionamento (e limite il potenziale per emodiluizione) necessari per la diagnostica accurata e ulteriori ricerche. Queste considerazioni pre-analitiche sono anche degli approcci MRD di vitale importanza per molecolare (PCR e NGS). Tutti gli esemplari per immunophenotyping dovrebbero essere trattati preferenzialmente entro 24 h dalla raccolta. Anche se non raccomandabile, midollo osseo e campioni di sangue periferici ancora possono elaborati e analizzati fino a 72 h, conservato a temperatura ambiente. Inoltre, tutte le manipolazioni con il materiale devono essere eseguite in condizioni di sterilità, al fine di consentire la crioconservazione di cellule sterili per la successiva valutazione di ricerca/qualità ecc.

<table><tbody><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>120995496,060996589 e 013729</td><td>FACS Canto II&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>555360</td><td>CD7 FITC</td></tr><tr><td></td><td>DAKO</td><td>F076701</td><td>CD2 FITC</td></tr><tr><td></td><td>Sanquin</td><td>M1613</td><td>CD36 FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>332778</td><td>CD15 FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>335039</td><td>CD45RA FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345810</td><td>CD56 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>337899</td><td>CD22 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345785</td><td>CD14 PE</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-801</td><td>CD133 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>562566</td><td>Clec12a PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>565568</td><td>Tim-3 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>332774</td><td>CD7 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>333142</td><td>CD11b PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>337899</td><td>CD22 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345810</td><td>CD56 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>347222</td><td>CD34 PERCP-CY5.5</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>558714</td><td>CD123 PERCP-CY5.5</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>B49221</td><td>CD117 PE-CY7</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>562854</td><td>CD33 BV421</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345791</td><td>CD19 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>333143</td><td>CD11b APC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345800</td><td>CD33 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345807</td><td>CD38 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>641411</td><td>HLA-DR APC-H7</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>560532</td><td>CD44 APC-H7</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>562596</td><td>CD13 BV421</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>348811</td><td>CD34 PE-CY7</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>A96416</td><td>CD45 Krome Orange</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>655873</td><td>CD45 HV500c</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td>perline CST&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>Soluzione</td></tr><tr><td></td> di lisi farmaceutica <td>BD Biosciences</td><td>644204</td><td>Multicolor CompBeads</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td>Perline</td></tr><tr><td></td> CST <td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSDiva software</td></tr><tr><td></td><td>Cytognos</td><td></td><td>Infinicyt</td></tr><tr><td></td><td>Spherotech</td><td>Euroflow RCP-30-5a</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Soluzione</td><td></td> Sigma-Aldrich <td></td> Tuerk</tr><tr><td>Spherotech</td><td>BCP-100-5</td><td>Perline di calibrazione in bianco</td>&nbsp;<td></td></tr><tr><td> &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>HSA</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>azoturo</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>ddH2O</td></tr></tbody></table>

protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Criteri di risposta nella leucemia mieloide acuta (AML) recentemente è stato ristabilito, con esame morfologico utilizzato per determinare se i pazienti hanno realizzato la remissione completa (CR). Circa la metà dei pazienti adulti che sono entrati CR sarà ricaduta entro 12 mesi dovuto la conseguenza di cellule residue di AML nel midollo osseo. La quantificazione di questi restanti cellule di leucemia, note come malattia residua minima o misurabile (MRD), può essere un biomarcatore affidabile per la previsione di queste ricadute. Inoltre, l'analisi retrospettiva di numerosi studi ha dimostrato che la presenza di MRD nel midollo osseo dei pazienti LMA correla con la sopravvivenza difficile. Non solo è la totale popolazione leucemica, riflessa dalle cellule che harboring una leucemia associato immunitario-fenotipo (LAIP), connesso con risultato clinico, ma così è la sottopopolazione immaturo bassa frequenza delle cellule staminali leucemia (LSC), entrambi i quali possono essere monitorati tramite flusso cytometry MRD o MRD-come approcci. La disponibilità di test sensibili che permettono l'individuazione delle cellule di leucemia residua (staminali) in base alle caratteristiche specifiche di malattia o malattia-collegati (marcatori molecolari anormali o aberrante immunophenotypes) hanno drasticamente migliorato MRD valutazione in AML. Tuttavia, data l'intrinseca eterogeneità e complessità di AML come una malattia, metodi per il campionamento del midollo osseo e l'analisi MRD e LSC devono essere armonizzate quando possibile. In questo manoscritto che descriviamo una metodologia dettagliata per adeguata midollo osseo aspirato di campionamento, trasporto, esempi di elaborazione per la valutazione di citometria a flusso multi-colore ottimale e gating strategie per valutare MRD e LSC per aiutare nel processo decisionale terapeutico per i pazienti AML.

Nel 90% dei pazienti LMA può essere identificato almeno un LAIP. Al fine di generare le percentuali precise di cellule LAIP + il primitive delle cellule di scoppio al momento della diagnosi, l'impostazione appropriata del cancello blast è cruciale ed esigenze di verifica come visualizzato nella Figura 3. Un esempio di ogni paziente che harboring un tipo specifico di aberranza sulle cellule CD34 + primitive viene visualizzato in Figura 5. Per la misurazione di MRD di follow-up, la precedenza definito LAIP + cellule sono gated e definite come percentuale di cellule LAIP + del WBC. Quindi l'impostazione di questo cancello è fondamentale per ottenere i giusti risultati MRD. Figura 6 Mostra un paziente che rimane nella remissione completa e un paziente che ricadute dopo avere risultati positivi MRD (≥ 0,1%) dopo il secondo ciclo di terapia di induzione.
Il protocollo attuale è solo adatto per definire le cellule staminali in cellule CD34 +, poiché approfondita caratterizzazione di questo comparto ha mostrato che il CD38-popolazione porti il più potente della cellula formativa come frazione. Al fine di separare la LSC da HSC all'interno di questa frazione, ulteriori marcatori vengono utilizzati. Marcatori più spesso selezionati per distinguere LSC sono CD45RA e il canale di combi che harboring 6 marcatori specifici di LSC etichettati con PE. Basato su ulteriori valutazioni cliniche, un livello di cut-off di ≥ 0,004% è stato definito come LSC-positivo ed è stato associato con una sopravvivenza peggiore alla diagnosi mentre un livello di cut-off di 0,0001% è stato utilizzato follw-up10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig1.jpg"> Figura 1 : Sbavatura del midollo osseo. A) sano donatore e paziente B) AML (sottotipo FAB 5). Colorazione di Giemsa mostrato ad ingrandimento 100x. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig2.jpg"> Figura 2 : Correggere il materiale di imballaggio per liquidi biologici. Maggiori dettagli sulle regole di trasporto di fluidi biologici si trovano presso il sito Web15 dei centri per controllo e la prevenzione. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig3.jpg"> Figura 3 : Strategia per la definizione di blastomeri di gating. A) Gating CD45dim, B) Gating CD34 + esplosioni.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig4.jpg"> Figura 4 : Gating linfociti. A) cellule blu sono WBC indicato nel plot FSC/SSC, cellule B) verde sono linfociti caratterizzati da CD45alta/SSCbasso, C) esempi di negatività per CD34, D) negatività per CD117 ed E) negatività per CD13, F) i diversi tipi cellulari sono riportati un albero di popolazione di panoramica. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig5.jpg"> Figura 5 : LAIPs al momento della diagnosi AML. A) LAIP basata su croce lignaggio aberrancy (CD7 sulle cellule esprimenti CD33), B) LAIP basato sulla differenziazione asincrona (CD11b sulle cellule esprimenti CD13), C) LAIP basato su sovraespressione rispetto alle cellule normali (CD34molto alta su CD13 che esprimono le cellule), D). LAIP basato su sottoespressione rispetto alle cellule normali (HLA-DRbasso su CD33 che esprimono le cellule). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig6.jpg"> Figura 6 : LAIP seguita durante la terapia. Definizione di A) LAIP alla diagnosi (CD34 + CD13 + / CD33-) e perdita di LAIP durante il follow-up in un paziente che è rimasto in remissione completa continua, definizione di B) LAIP alla diagnosi (CD117 + CD7 + / CD33 +) e persistenza di LAIP durante il follow-up in un paziente che è ricaduto. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig7.jpg"> Figura 7 : Cellule staminali gating. A) Gating dei diversi CD34 + CD38 popolazioni basato su beads (CD38basso è sotto il bordo superiore delle perline, mentre CD38 sono definiti come le vere cellule negative che rappresenta il LSCmolto bassa e si trovano sotto la mediana delle perle), B) due esempi di pazienti con distinzione tra HSC e LSC al follow-up basato su CD45RAneg e CD45RApos espressione. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_1.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_2.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Supplementary_information_revised_Cloos_et_al_final2018.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Rilevazione della malattia residua minima o misurabile (MRD) è un biomarcatore prognostico importante per raffinazione di valutazione del rischio e la previsione di ricaduta in leucemia mieloide acuta (AML). Queste linee guida complete e consigli con le migliori pratiche di coerente e accurata individuazione e rilevazione del MRD, può essere di aiuto nel prendere le decisioni efficace trattamento di AML.

Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di eseguire un test accurato su campioni di midollo osseo da pazienti con leucemia mieloide acuta per la malattia residua misurabile, inclusa la quantificazione delle cellule staminali leucemiche. Questo metodo può fornire una valutazione accurata della malattia residua misurabile in campioni di midollo osseo di pazienti con leucemia mieloide acuta. Il vantaggio principale di questo approccio è che un attento seguito del protocollo produce risultati altamente riproducibili e di alta qualità.Le implicazioni di questa tecnica si estendono al processo decisionale clinico in quanto può essere utilizzata come lettura della risposta dei pazienti al trattamento. A dimostrare le procedure saranno Jeroen Janssen, ematologo, Gerrit Sijm, tecnico del laboratorio di ematologia diagnostica e Jennifer Scheick e Sander Snel, tecnici del team MRD. Con il paziente in posizione di decubito laterale, contrassegnare la spina iliaca posteriore superiore con una penna e disinfettare la pelle dell'area bioptica prevista con clorexidina in etanolo allo 0,5-1% con un movimento circolare verso l'esterno.Dopo aver somministrato un anestetico locale, prendi un ago calibro 15 da 2,8 pollici con l'estremità prossimale nel palmo e l'indice contro il lato dell'asta metallica dell'ago vicino alla punta per il controllo. Esercitando una pressione delicata ma decisa, introdurre l'ago con un rapido movimento pronatore alternato e supinato attraverso la pelle anestetizzata verso la spina iliaca. Quando l'ago entra in contatto con la spina iliaca posteriore, rimuovere la stilette e collegare una siringa vuota da 10 millilitri all'ago.Estrarre delicatamente lo stantuffo per creare una pressione negativa all'interno della siringa fino a quando non sono stati raccolti fino a 10 millilitri di spicole del midollo osseo. Non assumere più di 10 mil di midollo osseo per aspirato per evitare l'emodiluizione. Togli la siringa e rimetti la stilette sull'ago.Quindi, espellere circa due millilitri di midollo in un vetro dell'orologio e assicurarsi che venga prelevato un campione sufficiente per essere iniettato in una provetta da otto millilitri rivestita di eparina e capovolgere immediatamente la provetta. Per prevenire la coagulazione, è importante investire il tubo contenente anticoagulante non appena viene aggiunto il midollo osseo. Per una valutazione morfologica ottimale, utilizzare una spatola di plastica per trasferire le spicole dall'aspirato nel vetro dell'orologio su un vetrino e far scorrere con cautela un altro vetrino sulla parte superiore del midollo.Dopo l'essiccazione, colorare le spicole con May-Grunwald Giemsa per l'analisi al microscopio ottico. Posizionare la provetta per il midollo osseo in un supporto di plastica e posizionare il supporto in un contenitore di plastica con una confezione di gel a temperatura ambiente e un modulo di richiesta compilato. Prima di analizzare il midollo osseo mediante citometria a flusso, avviare il citometro a flusso e aprire il software di analisi della citometria a flusso per creare un nuovo esperimento con un diagramma a punti a dispersione diretta rispetto a quello a dispersione laterale.Per valutare le dimensioni e la granularità delle cellule, caricare le cellule del sangue periferico lisate non marcate da un donatore sano e selezionare la funzione Acquisisci cellule. Gate dei linfociti e regolazione delle tensioni di dispersione diretta e laterale per raggiungere i valori target medi appropriati per la popolazione di cellule gated. Quindi, acquisisci i dati per almeno 10.000 eventi.Per impostare le tensioni del tubo del fotomoltiplicatore del canale di florescenza target, utilizzare prima le particelle di calibrazione della perlina arcobaleno a otto picchi secondo le istruzioni del produttore per acquisire 10.000 eventi a una bassa portata. Gate le perline singoletto nel grafico a punti di dispersione in avanti rispetto a quello laterale, seguito dal gating del 7° picco nel grafico a punti FITC-PE. Gate le popolazioni di perline risultanti per ciascun fluoroforo.Continuare l'acquisizione della sospensione a sfere arcobaleno a otto picchi e regolare e mettere a punto le tensioni PMT in tutti i canali di fluorescenza per raggiungere i valori MFI target secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare Registra per raccogliere i dati di circa 2.000 eventi e controllare l'MFI per le perle del 7° picco. Successivamente, aggiungere un volume sufficiente di ciascun anticorpo sperimentale coniugato al fluorocromo per colorare le perle nei corrispondenti tubi di florescenza meno un controllo e agitare accuratamente i tubi.Creare un nuovo esperimento in bianco con gli stessi parametri di compensazione, facendo attenzione che la soglia di dispersione diretta sia impostata su 5.000 e che i valori di compensazione di tutti i fluorocromi siano pari a zero. Per creare i controlli di compensazione, selezionare la funzione Crea controllo di compensazione e caricare il tubo di controllo non colorato. Regolare il gate P1 attorno alla popolazione di perline singoletto e verificare che il gate P1 contenga solo perline singoletto.Fare clic con il pulsante destro del mouse sul gate P1 e selezionare Applica a tutti i controlli di compensazione. Quindi, registrare i dati per tutti i singoli tubi di florescenza marcati confermando che il gate P2 comprende la popolazione positiva su ciascun istogramma di florescenza. Per colorare le cellule per l'analisi citofluorimetrica, trasportare il midollo osseo in laboratorio, controllare il modulo di richiesta per verificare il numero di studio del paziente e la data di nascita e determinare cosa deve essere colorato.Per la MRD, utilizziamo un pannello colorante composto da quattro tubi. Qui dimostriamo la colorazione del pannello LSC che consiste in un tubo. Dopo la conta cellulare, trasferire il volume appropriato di midollo osseo in una nuova provetta da 15 millilitri.Aggiungere un tampone di lisi a 10 volte il volume cellulare sperimentale per lisare i globuli rossi. Capovolgere la provetta per mescolare e incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine del periodo di lisi, pellettare le celle mediante centrifugazione.Risospendere le celle in 15 millilitri di tampone di lavaggio a temperatura ambiente e raccogliere nuovamente il pellet di celle mediante centrifugazione. Nel frattempo, pipettare la quantità appropriata di soluzione per cocktail di anticorpi in provette FACS da cinque millilitri. Qui è mostrato il pannello per il tubo delle cellule staminali.Risospendere il pellet nel tampone di lavaggio e aggiungere la sospensione della cellula alla provetta FACS contenente la soluzione cocktail di anticorpi monoclonali per un'incubazione di 15 minuti al buio. Quindi, lavare le celle nel tampone di lavaggio e pellettare le celle mediante centrifugazione. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet in 400 microlitri di tampone di lavaggio fresco.Per analizzare le cellule staminali leucemiche, aggiungere quattro microlitri di perle bianche alla sospensione cellulare che viene colorata con il cocktail di anticorpi delle cellule staminali. Quindi, leggere i campioni utilizzando i parametri precedentemente impostati acquisendo almeno quattro volte da 10 a 6 eventi dai campioni di pazienti sperimentali. Per identificare l'immunofenotipo associato alla leucemia osservato in circa il 90% dei pazienti con leucemia mieloide acuta, è fondamentale che le paratoie siano impostate in modo appropriato come illustrato.Qui, vengono mostrati esempi di dati di singoli pazienti che presentano diversi tipi di aberranza sulle cellule primitive CD34-positive. In questi grafici, si può osservare un paziente che rimane in remissione completa e un paziente che ha avuto una recidiva dopo aver avuto risultati positivi misurabili di malattia residua dopo il secondo ciclo di terapia di induzione, sottolineando la necessità di un'accurata impostazione del cancello prima dell'analisi del campione. L'identificazione e la quantificazione delle LSC richiede un'ulteriore analisi delle aberranze, in particolare sulle cellule blastiche CD34-positive CD38-negative, come mostrato in questi grafici.Durante l'esecuzione di questo protocollo, è molto importante disporre di personale specializzato e di supporto per il campionamento del midollo osseo, il trasporto, il lavoro sperimentale e le fasi di analisi di questa procedura. Questa procedura può essere utilizzata anche per eseguire analisi citogenetiche e molecolari per rispondere a ulteriori domande sulla correlazione tra specifiche popolazioni cellulari e aberranze molecolari di interesse, o per affinare il gruppo di rischio di un paziente per prevedere l'esito clinico. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ematologia per esplorare la malattia residua nei pazienti con LMA dopo il trattamento.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identifichiamo e quantifichiamo accuratamente la malattia residua utilizzando la citometria a flusso, inclusa la raccolta e il trasporto di campioni di midollo osseo di pazienti con LMA.

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Questo video descrive la tecnica di aspirazione del midollo osseo dalla colonna vertebrale iliaca e la preparazione dello striscio per la biopsia. Nell'esempio, eseguiamo l'aspirazione del midollo osseo da un paziente con leucemia mieloide acuta (LMA) ed esaminiamo le cellule per verificare la presenza di malattia residua misurabile (MRD), un importante biomarcatore prognostico.

Aspirazione del midollo osseo: un metodo per ottenere il midollo osseo per esaminare la morfologia cellulare

Descriviamo un protocollo per rilevare l'espressione simultanea di marcatori di cellule staminali leucemia sulle cellule di leucemia mieloide acuta primaria tramite flusso cytometry. Vi mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici e una popolazione di LSC putativa con crescente grado di maturazione. Abbiamo confermato la presenza di queste popolazioni in corrispondente paziente-derivato-xenotrapianti.

Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per isolare e caratterizzare le popolazioni microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindromi mielodisplastiche e leucemia mieloide acuta. Questa tecnica identifica i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo non ematopoietico, comprese le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, con progressione della malattia.

Identificazione delle popolazioni microambientali del midollo osseo nella sindrome mielodisplastica e nella leucemia mieloide acuta

Qui, viene descritto un metodo basato sulla citometria a fosfoflusso per analizzare la segnalazione a valle delle vie mTORC1, JAK/STAT5 e MAPK in cellule di leucemia mieloide umana acuta xenotrapiantate in topi e ottenute da aspirati di midollo osseo. I livelli di p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 e p-ERK1/2 vengono misurati simultaneamente utilizzando un citometro a flusso spettrale di nuova generazione ad alta sensibilità.

Citometria intracellulare a fosfoflusso di pazienti con leucemia mieloide acuta Xenotrapianti derivati da pazienti

Il protocollo ha l'obiettivo di descrivere un modello murino per la generazione di recidive di leucemia linfoblastica acuta, basato sulla dinamica della risposta alla chemioterapia di induzione.

Modello murino di recidiva della leucemia alla chemioterapia di induzione per la leucemia linfoblastica acuta

Questo protocollo descrive un metodo per la rapida trasformazione del post mortem diffuse campioni di glioma pontino intrinseca per la definizione di modelli di coltura cellulare derivati ​​da pazienti o la caratterizzazione diretta delle cellule tumorali e microambiente.

Un protocollo per Rapid post-mortem delle cellule Cultura della diffusa intrinseca Pontine glioma (DIPG)

Questo protocollo descrive l'uso di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga per separare le cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria in fasi del ciclo cellulare diverso.

Preparazione delle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria nel ciclo cellulare diverse fasi di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga

Questo protocollo descrive un'analisi di invasione verticale invertito che potrebbe essere utilizzata per quantificare le funzionalità di migrazione e invasione delle cellule in un ambiente tridimensionale, preservando il microambiente cellulare. Questo test è adatto per le cellule rare e/o sensibili.

Lo spostamento verso l'alto: Un semplice e flessibile In Vitro tridimensionale invasione protocollo di analisi

La coltura ex vivo degli espianti ossei può essere uno strumento prezioso per lo studio della fisiologia ossea e la potenziale valutazione dei farmaci nel rimodellamento osseo e nelle malattie ossee. Il protocollo presentato descrive la preparazione e la cultura delle calvarias isolate dai crani dei topi neonati, nonché le sue applicazioni.

Misurare il rimodellamento osseo e ricreare il microambiente tumore-osso utilizzando la co-cultura Calvaria e l'ibitorometria

Descriviamo un metodo per l'utilizzo di citometria a flusso multiparametrico per rilevare le specie di ossigeno reattivo mitocondriale (ROS) in cellule staminali e progenitrici (HSPC) e cellule leucemiche da un modello murino di leucemia mieloide acuta (AML) MLL-AF9.

Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia

Impara un protocollo accurato per analizzare campioni di midollo osseo nella leucemia mieloide acuta, misurando la malattia residua e le cellule staminali leucemiche tramite citometria a flusso.

Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta (Video) | JoVE Journal

Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

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