JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:43 min. • September 26th, 2025
Iniziare con estratti nucleotidici radiomarcati ottenuti da una coltura batterica prima e dopo l'induzione dello stress.
Sotto stress, gli enzimi batterici convertono la guanosina trifosfato e la guanosina difosfato in nucleotidi indotti dallo stress guanosina pentafosfato e guanosina tetrafosfato.
Individuare gli estratti su una piastra cromatografica a strato sottile pre-rivestita con un polimero cationico come fase stazionaria.
Posizionare la piastra in una camera contenente un tampone come fase mobile, assicurandosi che il liquido rimanga al di sotto del punto per evitare una diffusione precoce.
Consentire al tampone di risalire per azione capillare, separando i nucleotidi caricati negativamente in bande distinte in base alla loro carica e dimensione.
Dopo lo sviluppo, rimuovere la piastra, asciugare all'aria e tagliare la parte superiore per eliminare gli isotopi liberi e ridurre il segnale di fondo.
Esporre la piastra a uno schermo sensibile alle radiazioni per rilevare il segnale radioattivo.
L'aumento dei livelli di guanosina tetrafosfato e guanosina pentafosfato dopo l'induzione dello stress rivela cambiamenti dinamici nel pool di nucleotidi della guanosina.
Per prima cosa, prepara una lastra TLC in cellulosa PEI di 20 x 20 centimetri.
Usa le forbici per rimuovere i primi cinque centimetri e usa una matita morbida per segnare una linea di origine a un centimetro dal bordo. Applicare una goccia di cinque microlitri di ciascun campione sulla superficie del PEI.
Prima che la macchia possa asciugarsi, trasferire la piastra in un serbatoio contenente uno strato di fosfato monopotassico molare da 1,5 molari sufficientemente basso da non toccare la macchia del campione di origine. Coprire il serbatoio con una chiusura ermetica e lasciare che il liquido risalisca fino alla sommità del foglio rifilato di 15 centimetri. Successivamente, rimuovere il cromatogramma completamente sviluppato e asciugarlo all'aria a temperatura ambiente.
Tagliare e scartare la parte superiore del cromatogramma contenente il P32 libero in rifiuti radioattivi. Utilizzare uno schermo al fosforo per esporre le pellicole audioradiografiche durante la notte. Il giorno successivo, sviluppare la pellicola e utilizzare una phosphorimager per catturare e quantificare il segnale verde del fosforo.
Quindi, utilizzare il software ImageJ per quantificare le macchie radioattive.