Preparazione e trasformazione di batteri mediante elettroporazione ad alta tensione

Inizia con un tubo contenente batteri inoculati in un mezzo nutritivo.

Incubare agitando fino a quando le cellule raggiungono la fase di divisione attiva.

Centrifugare per raccogliere le cellule e scartare il surnatante.

Lavare ripetutamente le cellule con glicerolo ghiacciato per rimuovere i sali e risospendere in glicerolo per mantenere la vitalità cellulare.

Preparare un plasmide contenente un gene di resistenza agli antibiotici in acqua sterile con EDTA per prevenire la degradazione del DNA.

Mescolare la soluzione plasmidica con le cellule batteriche.

Applicare un breve impulso ad alta tensione per creare temporaneamente pori nella membrana batterica.

Ciò consente al DNA plasmidico di entrare nel citoplasma.

Trasferire immediatamente le cellule in un terreno di recupero e incubare agitandole.

I componenti del mezzo supportano la riparazione della membrana e l'espressione genica della resistenza agli antibiotici codificata da plasmidi.

Distribuire le cellule sull'agar nutriente contenente l'antibiotico e incubare fino a formare le colonie.

Scegli una singola colonia e mettila su un piatto fresco per purificare i trasformanti.

Per iniziare l'esperimento, preparare cellule elettrocompetenti del ceppo top 10 di E. coli .

Trasferire una singola colonia in un millilitro di terreno LB. Incubare la provetta a 37 gradi Celsius agitando a 180 giri/min. Diluire quello di pre-coltura a 500 in 25 millilitri di terreno LB fresco e incubare la coltura a 37 gradi Celsius fino a raggiungere la fase logaritmica 0,6 OD. Centrifugare la sospensione della cella a 5.000 giri/min per 20 minuti.

Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet in 25 millilitri di 10% volume per volume, ghiacciato, acqua di glicerolo sterile, e ripetere questo passaggio quattro volte, avendo il volume di risospensione ogni volta fino a raggiungere 1,5 millilitri.

Successivamente, risospendere il pellet in glicerolo al 10% e dividere la sospensione cellulare in aliquote da 50 microlitri. Conservare le aliquote a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per un massimo di sei mesi. Per continuare l'esperimento, sciogliere il plasmide desiderato in acqua sterile integrata con EDTA 0,5 millimolare e scongelare un'aliquota di cellule elettrocompetenti su ghiaccio.

Aggiungere da 2,5 a 5 nanogrammi di vettore e mescolare le cellule scongelate. Erogare le cellule in una cuvetta da 0,1 centimetri. Applicare un impulso di 1,8 kilovolt alle celle e trasferire immediatamente le celle elettroporate in un millilitro di mezzo SOC.

Incubare le cellule agitando per un'ora, trasferire 100 aliquote da microlitro in piastre di Petri contenenti agar LB e antibiotico e incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius. Purifica i trasformanti strisciando singole colonie su piastre di Petri.