Name: Rilevazione di modificazioni post-traduzionali in nativo nucleosomi intatto da ELISA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Scopri il metodo NU-ELISA per rilevare modificazioni post-traduzionali nei nucleosomi intatti. Questa tecnica sensibile permette di analizzare gli stati globali della cromatina nelle cellule mammifere.

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Sviluppo del NU-ELISA metodo è stato sostenuto da NIH concedere RO1AG023687.

1. Colture cellulari di mammifero NU-ELISA può essere eseguita su qualsiasi tipo di cellula di mammifero che si può crescere in coltura. Noi preferiamo preparare da moderati a grandi lotti di cellule in modo che nucleosomi possono essere isolati in quantità sufficiente per preparare diversi piatti identico caricato ELISA, consentendo test con diversi anticorpi (Abs). Le scale cultura seguenti forniscono ampio materiale: Per il mouse cellule staminali embyronic, crescere uno o due 15 tavole cm di cellule senza cellule alimentatore. Per i fibroblasti, crescere 5-10 15 piatti cm a confluenza. 2. Isolamento dei nuclei Nota: Tutti i passi sono sul ghiaccio con pre-raffreddata buffer, ad eccezione di quanto indicato. <ol><li> Trypsinize celle con 3 tripsina ml per piastra, combinare e aggiungere 20 ml di ghiacciata PBS / butirrato. Centrifugare a 1000 rpm per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule in 10 ml di PBS / butirrato e centrifugare a 1000 rpm per 5 min. </li><li> Risospendere in 4 ml di tampone di lisi con inibitori della proteasi (Sigma-Aldrich P-8340). Dounce omogeneizzare 20 colpi di pestello di tipo B sul ghiaccio. </li><li> Centrifugare a 2000g per 10 minuti a 4 ° C. (Il supernatante contiene citoplasma, che non è necessario per questo protocollo, ma può essere salvato per altri usi se lo si desidera). </li><li> Risospendere il pellet in 2 ml di ghiaccio freddo lavare tampone C (con inibitori della proteasi). </li><li> Strato di materiale risospeso in 5 ml cuscino di saccarosio 30%, poi centrifugare a 2400g per 5 minuti in un rotore oscillante. I nuclei migreranno attraverso cuscino, e detriti rimane a livello di interfaccia. </li><li> Rimuovere tutti i volumi di liquido con attenzione e risospendere i nuclei in 250 microlitri di tampone di lavaggio ghiacciata C + inibitori della proteasi. </li></ol> 3. Isolamento dei nucleosomi da parte in situ Micrococcal nucleasi (MNase) digestione Noi utilizziamo una procedura in cui viene digerito cromatina in situ all'interno di nuclei da infondendo loro MNase, seguito da un trattamento ipotonico a guidare senza nucleosomi intatti nel sopranatante. <ol><li> Aggiungere 3 ml 0,1 M CaCl 2 al campione. Mettere in 37 blocchi ° C Calore. Permettono di assumere 37 ° C di temperatura. </li><li> Aggiungere 2 unità MNase (Micrococcal nucleasi, Sigma-Aldrich, sciolto in 2 units/10μl nel buffer MNase), poi incubare a 37 ° C per 12 minuti, con frequenti rimontaggi con una punta di pipetta. </li><li> Aggiungere 6 ml di 0,5 M Na-EDTA, pH 8,0 per arrestare la reazione. Mettere in ghiaccio. </li><li> Centrifugare a 2000g per 4 minuti, scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 300 ml 0,2 mm Na-EDTA. Conservare in ghiaccio per 1 ora con occasionali pipeting gentile. (Queste condizioni ipotoniche liberare nucleosomi privi di nuclei). </li><li> Centrifugare a 3000 g per 4 minuti a 4 ° C. Salvare il surnatante, che contiene nucleosomi libero, sul ghiaccio. </li><li> Risospendere il pellet di nuovo con 300 ml 0,2 mm Na-EDTA. Conservare in ghiaccio per 1 ora con occasionali pipeting gentile. </li><li> Centrifugare a 3000g per 4 min a 4 ° C. Conservare il surnatante e si combinano con il sopranatante primo passo 5. I preparativi mononucleosome risultante può essere aliquotati e conservati a -80 ° C. </li></ol> Nota: la quantità di cromatina può essere crudamente quantificato misurando l'assorbanza a 260 nm di un campione di 10 microlitri aggiunto a 990 ml di acqua. A 260 = 10 (dopo aggiustamento per i 1 / 100 di diluizione) corrisponde a circa 1mg/ml della cromatina. Inoltre, durante la procedura di cui sopra, piccoli campioni possono essere conservati e successivamente analizzate per il loro contenuto di DNA per monitorare la qualità e l'estensione della digestioni MNase, che dovrebbe prevalentemente contengono DNA di 146 bp di lunghezza. Laddering è indicativo di digestione MNase incompleta. Nota: Fig.1 contiene una sintesi diagramma di isolamento nucleare e digestioni MNase passi. 4. Nucleosoma-ELISA (NU-ELISA) Rileviamo PTM sulle frazioni contenenti nativo nuclesosomes intatto che sono stati immobilizzati su 96 e piastre microtiter ELISA. Per ogni campione, facciamo una serie di 2-diluizioni, e questi sono rivestiti su pozzi in triplice copia. <ol><li> Cappotto piastre Maxisorp notte a 4 ° C con 50 microlitri / pozzetto di nucleosomi diluito in tampone di rivestimento. Suggerito diluizioni duplice serie di nucleosomi sono preparati dalla prima riga per riga in basso con l'aggiunta di 0,1 mg, 0,05 mg, 0.025 mg, 0,0125 mg, mcg 0,00625, 0,00313 mg, 0,00156 mg, con tampone di rivestimento solo (0 cromatina mcg) nella parte inferiore fila. (Nota: comprende piastra sono necessari per questo passaggio.) </li><li> Al mattino, lavare i piatti 4 volte con 200 l / pozzetto PBS/0.5% di Tween-20 a temperatura ambiente (RT) per un totale di 10 min con una rondella di piatto. </li><li> Blocco 1 ora a temperatura ambiente con 100 l / pozzetto PBS/0.05% di Tween-20 / 5% BSA. </li><li> Rimuovere il tampone di bloccaggio agitando la piastra capovolta vivacementepiù di un lavandino. Coprire e conservare le piastre a -20 ° C, o andare direttamente alla fase successiva. </li><li> Aggiungere 1 ° Abs in un volume di 50 microlitri / ben diluito 1:1000 (o secondo necessità) in PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA, incubare a RT per 1 ora su un rotatore. </li><li> Lavare le piastre 4 volte con 200 l / pozzetto PBS/0.5% di Tween-20 a temperatura ambiente e per un totale di 10 min in una lavatrice piatto. </li><li> Aggiungi rafano perossidasi di cavallo (HRP)-coniugato 2 ° Abs, diluito 1:5000 (o secondo necessità) in PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA a temperatura ambiente per un'ora su un rotatore. </li><li> Lavare le piastre 4 volte con 200 l / pozzetto PBS/0.5% di Tween-20. Ogni lavaggio è a temperatura ambiente e per un totale di 10 minuti con una rondella di piatto. </li><li> Sviluppare i piatti aggiungendo 50 l di substrato TMB ad ogni pozzetto per 10 minuti a temperatura ambiente. Bloccare la reazione aggiungendo 50 microlitri / pozzetto di 2N H 2 SO 4 e leggere le piastre 450 nm. (Suggerimento: Centrifugare a 1500 rpm per 2 minuti utilizzando un rotore piatto per dissipare eventuali bolle d'aria nei pozzetti prima assorbanze lettura). </li><li> Esportare le letture ad un foglio elettronico per analisi quantitative e statistiche. </li></ol> Reagenti <table border="1"><tbody><tr><td> PBS / butirrato </td></tr><tr><td> 135 mM NaCl </td></tr><tr><td> 2,5 mM KCl </td></tr><tr><td> 8 mM Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1,5 mM KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-butirrato </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Lysis Buffer </td></tr><tr><td> 250 mm di saccarosio </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-butirrato </td></tr><tr><td> 4 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0,1% Triton X-100 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Tampone di lavaggio C </td></tr><tr><td> 250 mm di saccarosio </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-butirrato </td></tr><tr><td> 4 mM MgCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Saccarosio Cuscino </td></tr><tr><td> 30% (w / v) di saccarosio nel tampone di lavaggio C </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Microccocal nucleasi Buffer </td></tr><tr><td> 5 NaPO mm 4 tampone, pH 7,0 </td></tr><tr><td> 0,025 mm CaCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Rivestimento tampone </td></tr><tr><td> Soluzione A + 80ml 170ml Soluzione B + 250ml dH 2 O </td></tr><tr><td> Soluzione A: 0,2 M Na 2 CO 3 </td></tr><tr><td> Soluzione B: 0,2 M NaHCO 3 </td></tr></tbody></table> 5. Rappresentante Risultati Utilizzando il NU-ELISA metodo, una serie di diversi piatti identici vengono preparati che possono essere caricati con cromatina preparato nella forma di mononucleosomes. Noi di solito preparare serie di identico-caricati piastre in modo che ciascuno può essere sondato con diversi anticorpi specifici anti-PTM (Abs). Abbiamo anche sempre preparare un piatto che può essere sondato con un Ab che rileva istoni senza riguardo al loro controllo totale stato di caricamento della cromatina modifica. Questo controllo è essenziale per poi confrontare quantitativamente contenuto PTM dei nucleosomi preparati da campioni diversi. Per quantificare i livelli di PTM all'interno di un campione di cromatina dato che correggere i valori di assorbanza prima con questo approccio: in primo luogo, si sottrae ogni segnale di fondo utilizzando i valori ottenuti da pozzetti di controllo che non contengono cromatina (sfondo di solito è trascurabile). Abbiamo poi standardizzare PTM-specifici segnali di NU-ELISA risultati ottenuti da una piastra identico carico che è stato testato con un Ab che rileva nucleosomi indipendentemente dal loro stato di modifica. (Abbiamo usato Abs policlonali specifici per gli istoni H2A e H2B per questo scopo). Siamo quindi determinare medie e le varianze per ogni diluizione della cromatina, e utilizzare i dati ottenuti dalla parte lineare del test ELISA. Esempi dettagliati di NU-ELISA analisi matematiche e statistiche sono state precedentemente riportate 4 <img src="/files/ftp_upload/2593/2593fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Schematica diagam di NU-ELISA passi. A. Le cellule di mammifero vengono raccolte; B. I nuclei sono separati dalle cellule da Dounce homogenization, C. Turbativa cellule vengono caricati sulla cima di un 30% w / v cuscino di saccarosio, D. Dopo la centrifugazione, i nuclei si depositano nel pellet, E, F. cromatina sono digeriti in situ principalmente per mononucleomes da MNase, G, H , io. mononucleosomes solubili sono estratte da un trattamento ipotonico e centrifugazione ripetuta di residui di materiale nucleare. Mononucleosomes J. da diversi campioni (con etichetta samp. 1 e 2 in questo caso) sono rivestiti in pozzetti in serie di identico caricati piatti e interrogati con PTM-specifici Abs e PTM-Abs indipendente per determinare il carico totale della cromatina. Rappresentazione K. di livelli di segnale di rilevazione differenziale in due campioni che si differenziano per il loro contenuto PTM, ancora simile contenuto complessivo della cromatina, come giudicato da anti-H2B immunoreattività.

<ol><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+and+an+epigenetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation and an epigenetic code.</a> Bioessays. 22, 836-845 (2000).</li>
<li>Dai, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epiproteomic+signatures+distinguish+embryonic+stem+cells+from+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells.</a> Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).</li>
<li>Tanasijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+accumulation+of+epigen+etic+heterogeneity+during+human+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture.</a> Epigenetics. 4, 330-338 (2009).</li>
<li>Thomas, J. O. Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThomas%2C+JO+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 12-14 (1998).</li>
<li>Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C. Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThorne%2C+AW+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 38-39 (1998).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

NU-ELISA fornisce un metodo per accertare lo stato globale di PTM nucleosoma presenti all&#39;interno di un particolare tipo di cellula. NU-ELISA studi hanno dimostrato che gli stati globali modifica nucleosoma differiscono in confronto dei tipi cellulari divergenti 4. Inoltre, NU-ELISA profili PTM cambiare quando le cellule sono esposte ad agenti modulatori epigenetici come tricostatina-A o quando il mouse cellule staminali embyronic sono differenziati 4. Il metodo è stato applicato con successo allo studio della cromatina delle cellule staminali embrionali umane 5. E &#39;importante notare la NU-ELISA, nella sua forma attuale, in grado di rilevare solo la firma composito di PTM presenti all&#39;interno della somma totale dei epigenoma cellulare. Questo si differenzia notevolmente da genome-wide immunoprecipitazione della cromatina, che può determinare la distribuzione di un PTM specifico attraverso specifici loci genetici. Le fasi iniziali del NU-ELISA procedure sono adattate da precedenti metodi per isolare mononucleosomes da nuclei mammiferi 6,7. Questi metodi adattato fornire un espediente per ottenere mononucleosomes intatto di alta qualità dalle cellule dei mammiferi, e le frazioni risultanti sono complete nel loro contenuto cromatina, ma contengono una grande quantità di ulteriore materiale nucleare. Dato che sono utilizzati Abs, contaminando non nucleosomal materiale è ben tollerato nel NU-test ELISA, a differenza di massa-spec approcci che richiedono una maggiore purezza. Tuttavia, NU-ELISA è più sensibile e quantitativo di western blotting 4, fornendo così buone alternative ai western e spettrometro di massa per la rilevazione dei PTM nucleosomal.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Micrococcal Nucleae </td><td> Sigma </td><td> N3755 </td><td> Fai aliquote di 2 tampone U/10μl, conservati a -20 ° C </td></tr><tr><td> Nunc Maxisorp microtitolazione Piastre </td><td> Pescatore </td><td> 12-565-135 </td><td> Copre targhetta adesiva possono essere ordinati anche tramite Fisher </td></tr><tr><td> Piastra Rondella automatica </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1-Step TMB-substrato ELISA </td><td> Perforare </td><td> 34028 </td><td> Conservare a 4 ° C pre-caldo per RT prima dell&#39;uso o come indicato sulla scheda tecnica </td></tr><tr><td> Lettore di micropiastre </td><td> Bio-Rad lettore di micropiastre (modello: 680) </td><td></td><td> La maggior parte dei modelli colorimetrici lettore di piastre sono adatti </td></tr></tbody></table>

rilevazione di modificazioni post-traduzionali in nativo nucleosomi intatto da elisa

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Il genoma degli eucarioti esiste come cromatina che contiene sia il DNA e le proteine. L&#39;unità fondamentale della cromatina è il nucleosoma, che contiene 146 paia di basi di DNA associate con due ciascuno degli istoni H2A, H2B, H3 e H4 1. N-terminale code degli istoni sono ricche di lisina e arginina e vengono modificati post-trascrizionalmente da acetilazione, metilazione e altre modificazioni post-traduzionali (PTM). La configurazione del PTM nucleosomi può influenzare l&#39;attività trascrizionale del DNA associate, fornendo così un modo di regolazione genica che è epigenetici in natura 2,3. Abbiamo sviluppato un metodo chiamato nucleosoma ELISA (NU-ELISA) per determinare quantitativamente firme PTM globale dei nucleosomi estratto dalle cellule. NU-ELISA è più sensibile e quantitativo di western blotting, ed è utile per interrogare lo stato epiproteomic di tipi cellulari specifici. Questo articolo di giornale video mostra le procedure dettagliate per eseguire NU-ELISA analisi.

Nucleosoma ELISA (NU-ELISA) è un metodo sensibile e quantitativa per rilevare modelli globali di modificazioni post-traduzionali nelle preparazioni dei nativi, nucleosomi intatto. Queste modifiche includono methylations, acetylations e fosforilazioni a specifici residui di aminoacidi degli istoni, e quindi NU-ELISA fornisce un test globale proteomica della complessivo stati modificazione della cromatina di tipi cellulari specifici.

Rilevazione di modificazioni post-traduzionali in nativo nucleosomi intatto da ELISA

Il genoma degli eucarioti esiste sotto forma di cromatina, che contiene sia DNA che proteine. L'unità fondamentale della cromatina è il nucleosoma, che contiene 146 ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare con precisione i livelli relativi delle modifiche post-traduzionali all'interno di preparazioni di nucleosomi cellulari totali ottenuti da un milione di cellule. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando colture omogenee di alta qualità di cellule di mammifero. Successivamente, i nuclei vengono isolati dalle cellule mediante rottura meccanica con un omogenizzatore Dounce e centrifugazione.Il passo successivo consiste nell'ottenere nucleosomi integri digerendo la cromatina presente all'interno dei nuclei e effettuando una serie di estrazioni ipotoniche. Infine, i nucleosomi vengono analizzati mediante un saggio ELIZA con i controlli appropriati per identificare specifiche modifiche post-traduzionali. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano i livelli relativi di modifiche specifiche presenti nei campioni di nucleosomi.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il western blotting e l'immunoprecipitazione della cromatina è che può essere facilmente ottenuta una visione globale di diversi stati di modificazione dei nucleosomi. Il metodo è molto più sensibile e accurato rispetto al western blotting e può essere eseguito nella maggior parte dei laboratori dotati di attrezzature per esperimenti di biologia molecolare generale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle cellule staminali e dell'epigenetica, ad esempio cosa accade durante eventi principali di differenziamento e riprogrammazione.Per iniziare la procedura, trattare innanzitutto le cellule con tre millilitri di tripsina per ogni piastra da 15 centimetri per ottenere cellule frescamente tripsinizzate. Aggiungere 20 millilitri di PBS freddo con butirrato ghiacciato. Trasferire le cellule in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugare il tubo per raccogliere le cellule a 1000 giri/min per cinque minuti, aspirare il soprannatante e aggiungere 10 millilitri di PBS freddo con butirrato ghiacciato per lavare; centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 1000 giri/min per cinque minuti.Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in quattro millilitri di buffer di lisi con inibitori delle proteasi come descritto nel protocollo scritto. Successivamente, trasferire le cellule con una pipetta in un omogenizzatore con pestello tipo B e omogeneizzare con 20 movimenti su ghiaccio. Quindi trasferire l'omogenato in un tubo da centrifuga posto su ghiaccio.Centrifugare il campione a 2000 G per 10 minuti, a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante, che contiene il materiale citoplasmatico e il resus.Sospendere il pellet in due millilitri di tampone di lavaggio freddo C contenente inibitori delle proteasi; sovrapporre delicatamente il materiale risospeso su un cuscino di cinque millilitri di saccarosio al 30% in una provetta da centrifuga fredda. Per isolare i nuclei, centrifugare a 2.400 ×g per cinque minuti in un rotore con becchi oscillanti: i nuclei migreranno attraverso il cuscino mentre i detriti cellulari rimarranno all'interfaccia. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione tutto il volume liquido e risospendere i nuclei in 250 microlitri di tampone di lavaggio freddo C con inibitori delle proteasi; trasferire quindi i nuclei in una microprovetta da 1,5 millilitri.Per iniziare l'isolamento dei nucleosomi, aggiungere tre microlitri di cloruro di calcio 0,1 molare ai nuclei e posizionare in un blocco termico a 37 gradi Celsius fino al raggiungimento dell'equilibrio termico. Quindi aggiungere due unità di micrococcal nuclease in 10 microlitri di buffer per micrococcal nuclease e incubare per 12 minuti a 37 gradi Celsius. Mescolare frequentemente con la punta di una pipetta.Dopo l'incubazione, fermare la reazione con sei microlitri di E-D-T-A di sodio 0,5 molarità a P-H 8 e porre sul ghiaccio per raffreddare. Successivamente, centrifugare il campione a 2000 ×g per quattro minuti; al termine della centrifugazione, scartare il soprannatante e risospendere il pellet in 300 microlitri di EDTA di sodio 0,2 millimolare. Incubare il campione sul ghiaccio per un'ora, mescolando occasionalmente con pipettatura delicata.Dopo una centrifugazione a 3000 G per quattro minuti, a quattro gradi Celsius, raccogliere il soprannatante, che contiene i nucleosomi liberi, in un nuovo tubo Eppendorf e conservarlo sul ghiaccio per un ulteriore utilizzo dei nucleosomi. Sospendere il pellet in 300 microlitri di EDTA sodico 0,2 millimolare come in precedenza e incubare sul ghiaccio per un'ora con mescolamento delicato occasionale.Dopo l'incubazione, centrifugare il campione. Nuovamente, combinare il surnatante risultante con il campione rimanente nel tubo microcentrifuga posto sul ghiaccio. Per iniziare il saggio nucleosoma Eliza, caricare una piastra Eliza a 96 pozzetti con una serie discendente di cinque diluizioni seriali due volte consecutive di nucleosomi e tampone di rivestimento, partendo da 0,1 microgrammi per 50 microlitri nel pozzetto superiore; ogni serie di diluizioni deve essere caricata in triplice replicato.Ricordarsi di includere pozzetti con solo tampone di rivestimento come controlli. Incubare la piastra durante la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Utilizzare un lavatore di piastre per lavare le piastre con 200 microlitri per pozzetto di PBS al 0,5% tra 20 a temperatura ambiente, quattro volte per un totale complessivo di 10 minuti.Ora aggiungere 100 microlitri per pozzetto di soluzione bloccante e incubare per un'ora a temperatura ambiente su un agitatore rotante. Al termine dell'incubazione, rimuovere il buffer bloccante scuotendo energeticamente la piastra capovolta sopra un lavandino. Successivamente, aggiungere l'anticorpo primario diluito in un volume di 50 microlitri per pozzetto in una soluzione di 5% PSA in 0,05% tra 20 in PBS e incubare la soluzione per un'ora su un agitatore rotante a temperatura ambiente.Dopo l'incubazione con l'anticorpo primario, lavare le piastre come in precedenza utilizzando il lavapiastre. Al termine della procedura di lavaggio, aggiungere 50 microlitri per pozzetto di anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano, diluito in PBS con 5% BSA e 0,5% Tween 20, e incubare a temperatura ambiente per un'ora su un agitatore rotante. Dopo l'incubazione con l'anticorpo secondario, lavare nuovamente le piastre come in precedenza.Utilizzare il lavatore di piastre per sviluppare la piastra. Aggiungere 50 microlitri di substrato TMB Eliza in ogni pozzetto e incubare per 10 minuti. A temperatura ambiente, i pozzetti della piastra ELIZA diventeranno blu e l'intensità sarà proporzionale alla quantità di modifiche dei nucleosomi presenti in ciascuno di essi.Bene, quindi arrestare la reazione aggiungendo 50 microlitri per pozzetto di acido solforico 2 N. Il colore diventerà marrone; centrifugare la piastra a 1500 giri al minuto per due minuti per eliminare eventuali bolle d'aria.La piastra è ora pronta per la quantificazione su un lettore di piastre colorimetrico. Infine, leggere la piastra a 450 nanometri ed esportare i risultati per l'analisi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se effettuata correttamente dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sulle cellule staminali per esplorare le risposte epigenetiche agli eventi di differenziamento e riprogrammazione a livello dell'intero epiproteoma.

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Ubiquitinazione è una modificazione post-traslazionale chiave svolto da una serie di tre enzimi. Le mutazioni di geni coinvolti in questa modifica sono associati a diverse malattie umane. Qui, descriviamo i protocolli per rilevare ubiquitinazione delle proteine ​​in cellule in...

Rilevamento di proteine ​​Ubiquitinazione

Combinando nativa e reticolazione cromatina immunoprecipitazione con alta risoluzione di Spettrometria di Massa, l'approccio ChroP permette di sezionare il composito dell'architettura proteomica delle modificazioni degli istoni, le varianti e le proteine ​​non istoniche Synergizing a domini di cromatina funzionalmente distinte.

L&#39;approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

Qui descriviamo saggi biochimici che possono essere utilizzati per caratterizzare gli enzimi di rimodellamento della cromatina ATP-dipendenti per le loro capacità di 1) catalizzare lo scorrimento dei nucleosomi ATP-dipendente, 2) interagire con i substrati nucleosomici e 3) idrolizzare l'ATP in modo nucleosoma-dipendente o DNA-dipendente.

Saggi biochimici per le attività di analisi ATP-dipendente rimodellamento della cromatina Enzimi

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro completamente integrato per la caratterizzazione di istone modificazioni post-traslazionali utilizzando la spettrometria di massa (MS). Il flusso di lavoro prevede la purificazione istone da colture di cellule o tessuti, istone derivatizzazione e la digestione, analisi MS utilizzando nano-flusso cromatografia liquida e le istruzioni per l'analisi dei dati. Il protocollo è stato progettato per il completamento entro 2 - 3 giorni.

Flusso di lavoro completo per l&#39;analisi dell&#39;istone modificazioni post-traduzionali Utilizzando Bottom-up Spettrometria di Massa: Da istone estrazione all&#39;analisi dei dati

Questo protocollo descrive la ricostituzione dei nucleosomi contenenti modo differenziale istoni sorella marcati con isotopi. Allo stesso tempo, nucleosomi asimmetricamente post-traduzionali modificati possono essere generati dopo utilizzando una copia istone premodified. Queste preparazioni possono essere facilmente utilizzati per studiare i meccanismi modifica diafonia, contemporaneamente su entrambi istoni sorella, utilizzando la spettroscopia NMR ad alta risoluzione.

Ricostituzione dei nucleosomi con differenzialmente marcati con isotopi sorelle istoni

Presentiamo un metodo efficace e riproducibile per isolare e coltura di cellule progenitrici neurali dal tessuto di cervello embrionale e postnatale per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di istone 3 lisina 79 dimethylation (H3K79me2) - un contrassegno dell'istone si trova all'interno del dominio globulare dell'istone 3.

Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark

Indagando più, modificazioni post-traduzionali endogeni per una proteina bersaglio possono essere estremamente impegnativi. Tecniche descritte qui utilizzano un sistema di tampone e di filtro ottimizzato Lisi sviluppato con PTM-targeting specifico, matrici di affinità per rilevare le modifiche di fosforilazione di acetilazione, ubiquitinazione, sumoilazione 2/3 e tirosina per una destinazione proteine utilizzando un unico sistema semplificato.

Che utilizzano un sistema di arricchimento di immunoprecipitazione completa per identificare un profilo di modificazione post-traduzionale endogeno per proteine bersaglio

L'ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale che svolge un ruolo importante nei processi cellulari ed è strettamente coordinata dalla deubiquitinazione. I difetti in entrambe le reazioni sono alla base delle patologie umane. Forniamo protocolli per condurre l'ubiquitinazione e la reazione di deubiquitinazione in vitro utilizzando componenti purificati.

In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici

Il presente protocollo evidenzia un metodo modificato per rilevare e quantificare i legami incrociati DNA-proteina (DPC) e le loro modificazioni post-traduzionali (PTM), tra cui l'ubiquitilazione, la SUMOilazione e l'ADP-ribosilazione indotte da inibitori della topoisomerasi e dalla formaldeide, consentendo così lo studio della formazione e della riparazione delle DPC e dei loro PTM.

Rilevazione quantitativa dei legami incrociati DNA-proteina e delle loro modificazioni post-traduzionali

Un flusso di lavoro analitico basato sulla cromatografia liquida, sulla spettrometria di mobilità ionica intrappolata e sulla spettrometria di massa a tempo di volo (LC-TIMS-TOF MS/MS) per un'analisi "bottom-up" ad alta affidabilità e altamente riproducibile delle modificazioni istoniche e l'identificazione in base ai parametri principali (tempo di ritenzione [RT], sezione d'urto di collisione [CCS] e rapporto massa-carica [m/z] accurato).

Screening della modificazione degli istoni mediante cromatografia liquida, spettrometria di mobilità ionica intrappolata e spettrometria di massa a tempo di volo

Varianti genetiche nel membro umano della famiglia Spindlin 4 (SPIN4) sono state recentemente identificate in pazienti con sovracrescita ossea, un nuovo disturbo dello sviluppo. Vengono presentati un protocollo e nuovi risultati che descrivono l'identificazione biochimica degli istones modificati nel contesto dei nucleosomi come substrati di legame allo SPIN4.

Identificazione degli istoni modificati come substrati di legame del membro della famiglia spindlina umana 4 (SPIN4) tramite array peptidici e pulldown dei nucleosomi nativi

Scopri il metodo NU-ELISA per rilevare modificazioni post-traduzionali nei nucleosomi intatti. Questa tecnica sensibile permette di analizzare gli stati globali della cromatina nelle cellule mammifere.

Rilevazione di modificazioni post-traduzionali in nativo nucleosomi intatto da ELISA

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