Rilevazione di modificazioni post-traduzionali in nativo nucleosomi intatto da ELISA

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di determinare con precisione i livelli relativi di modificazioni post-traduzionali all'interno di preparazioni di nucleosomi cellulari totali ottenuti da un milione di cellule. Ciò si ottiene preparando prima colture omogenee di alta qualità di cellule di mammifero. Quindi i nuclei vengono isolati dalle cellule attraverso la disgregazione meccanica con un downs, un omogeneizzatore e una centrifugazione.

Il passo successivo è quello di ottenere nucleosomi intatti digerendo la cromatina presente all'interno dei nuclei ed eseguendo una serie di estrazioni ipotoniche. Infine, i nucleosomi vengono interrogati utilizzando un test ELIZA con i controlli appropriati per identificare specifiche modifiche post-traduzionali. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano i livelli relativi di modifiche specifiche presenti all'interno dei campioni di nucleosomi.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il western blotting e l'immunoprecipitazione della cromatina è che è possibile determinare facilmente un quadro globale di un numero di stati di modificazione dei nucleosomi. Il metodo è molto più sensibile e accurato del western blotting e può essere eseguito nella maggior parte dei laboratori attrezzati per la sperimentazione di biologia molecolare generale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule staminali e dell'epigenetica, come ad esempio cosa succede quando si verificano importanti eventi di differenziazione e riprogrammazione.

Per iniziare la procedura, i primi tentativi di anizzazione delle cellule con tre millilitri di tripsina per piastra da 15 centimetri fino alle cellule appena tripizzate. Aggiungere 20 millilitri di butirrato di PBS ghiacciato. Trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri e centrifugare la provetta per raccogliere le cellule a 1000 giri/min per cinque minuti, aspirare il surnatante e aggiungere 10 millilitri di butirrato di PBS ghiacciato per lavare nuovamente la sospensione cellulare a 1000 giri/min per cinque minuti.

Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in quattro millilitri di tampone di lisi con inibitori della proteasi come descritto nel protocollo scritto. Quindi, pipettare le cellule in un omogeneizzatore a pestello A di tipo B su ghiaccio e omogeneizzare con 20 colpi. Quindi trasferire l'omogeneizzato in una provetta da centrifuga con ghiaccio.

Centrifugare il campione a 2000 G per 10 minuti. A quattro gradi Celsius. Rimuovere il super named, che contiene il materiale citoplasmatico e resus.

Sospendere il pellet in due millilitri di tampone di lavaggio a freddo ghiacciato C Con inibitori della proteasi, sovrapporre delicatamente il materiale risospeso su un cuscino di saccarosio al 30% da cinque millilitri in una provetta da centrifuga fredda. Per isolare la centrifuga dei nuclei a 2.400 G per cinque minuti in un secchio oscillante, i nuclei del rotore migreranno attraverso il cuscino e i detriti cellulari rimarranno all'interfaccia. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura tutto il volume del liquido e risospendere i nuclei in 250 microlitri di tampone C per lavaggio a freddo ghiacciato con inibitori della proteasi, trasferire i nuclei in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Per iniziare l'isolamento dei nucleosomi, aggiungere tre microlitri di cloruro di calcio molare 0,1 ai nuclei e metterli in un blocco termico a 37 gradi Celsius fino a quando la temperatura non è equilibrata. Quindi aggiungere due unità di micro nucleasi cocale in 10 microlitri di micro nucleasi coca, tamponare e incubare per 12 minuti a 37 gradi Celsius. Mescolare frequentemente con il puntale di una pipetta.

Dopo l'incubazione, interrompere la reazione con sei microlitri di sodio 0,5 molare E-D-T-A-P-H otto, e porre su ghiaccio a raffreddare. Quindi centrifugare il campione a 2000 G per quattro minuti dopo la centrifugazione, scartare la trappola e risospendere il pellet. In 300 microlitri di 0,2 millimoli o EDTA di sodio, incubare il campione su ghiaccio per un'ora con un pipettaggio delicato occasionale per mescolare.

Segue una centrifugazione a 3000 G per quattro minuti. A quattro gradi Celsius, raccogliere il surnatante, che contiene i nucleosomi liberi in un nuovo tubo Fuge e conservare su ghiaccio ulteriori nucleosomi deliberatamente aggiuntivi reus. Sospendere il pellet in 300 microlitri di 0,2 millimoli o EDT di sodio come prima e incubare su ghiaccio per un'ora mescolando delicatamente di tanto in tanto.

Dopo l'incubazione, centrifugare il campione. Ancora una volta, combina la trappola risultante con il campione rimanente nel tubo micro fuge sul ghiaccio. Per iniziare il test del nucleosoma Eliza, caricare una piastra Eliza a 96 pozzetti con una serie discendente di cinque diluizioni seriali doppie dei nucleosomi e del tampone di rivestimento, iniziando con 0,1 microgrammi per 50 microlitri nel pozzetto superiore, tutte le serie di diluizione devono essere caricate in triplice copia.

Ricordarsi di includere i pozzetti con tampone di rivestimento solo come controlli. Incubare la piastra per una notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Utilizzare una lavatrice per piastre per lavare le piastre con 200 microlitri per pozzetto dello 0,5% tra 20 in PBS a temperatura ambiente quattro volte per un totale combinato di 10 minuti.

Aggiungere ora 100 microlitri per pozzetto di soluzione bloccante e incubare per un'ora a temperatura ambiente su un rotatore. Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di blocco agitando energicamente la piastra capovolta su un lavandino. Successivamente, aggiungere l'anticorpo primario diluito in un volume di 50 microlitri per pozzetto in una soluzione di PSA al 5% in 0,05% tra 20 in PBS, incubare la soluzione per un'ora su un rotatore a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione dell'anticorpo primario, lavare le piastre come prima di utilizzare la lavatrice per piastre. Una volta completata la procedura di lavaggio, aggiungere 50 microlitri per pozzetto di anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano diluito in PBS con 5%BS, A e 0,5%20 incubare a temperatura ambiente per un'ora su un rotatore dopo l'incubazione dell'anticorpo secondario. Lavare i piatti come prima.

Utilizzando la rondella per piastre per sviluppare la piastra. Aggiungere 50 microlitri di substrato TMB Eliza a ciascun pozzetto e incubare per 10 minuti. A temperatura ambiente, i pozzetti della piastra ELIZA diventeranno blu e l'intensità è proporzionale alla quantità di modificazioni nucleosomiche presenti all'interno di ciascuno.

Bene, allora ferma la reazione. Aggiungendo 50 microlitri per pozzetto di due normali acidi solforici. Il colore cambierà in marrone: centrifugare la piastra a 1500 giri/min per due minuti per dissipare eventuali bolle d'aria.

La lastra è ora pronta per la quantificazione su un lettore di lastre metriche a colori. Infine, leggere la lastra a 450 nanometri ed esportare i risultati per l'analisi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se viene eseguita correttamente dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto le porte ai ricercatori nel campo della ricerca sulle cellule staminali per esplorare le risposte epigenetiche agli eventi di differenziazione e riprogrammazione a livello dell'intero epiproteoma.