Rilevazione di modificazioni post-traduzionali in nativo nucleosomi intatto da ELISA

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare con precisione i livelli relativi delle modifiche post-traduzionali all'interno di preparazioni di nucleosomi cellulari totali ottenuti da un milione di cellule. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando colture omogenee di alta qualità di cellule di mammifero. Successivamente, i nuclei vengono isolati dalle cellule mediante rottura meccanica con un omogenizzatore Dounce e centrifugazione.

Il passo successivo consiste nell'ottenere nucleosomi integri digerendo la cromatina presente all'interno dei nuclei e effettuando una serie di estrazioni ipotoniche. Infine, i nucleosomi vengono analizzati mediante un saggio ELIZA con i controlli appropriati per identificare specifiche modifiche post-traduzionali. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano i livelli relativi di modifiche specifiche presenti nei campioni di nucleosomi.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il western blotting e l'immunoprecipitazione della cromatina è che può essere facilmente ottenuta una visione globale di diversi stati di modificazione dei nucleosomi. Il metodo è molto più sensibile e accurato rispetto al western blotting e può essere eseguito nella maggior parte dei laboratori dotati di attrezzature per esperimenti di biologia molecolare generale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle cellule staminali e dell'epigenetica, ad esempio cosa accade durante eventi principali di differenziamento e riprogrammazione.

Per iniziare la procedura, trattare innanzitutto le cellule con tre millilitri di tripsina per ogni piastra da 15 centimetri per ottenere cellule frescamente tripsinizzate. Aggiungere 20 millilitri di PBS freddo con butirrato ghiacciato. Trasferire le cellule in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugare il tubo per raccogliere le cellule a 1000 giri/min per cinque minuti, aspirare il soprannatante e aggiungere 10 millilitri di PBS freddo con butirrato ghiacciato per lavare; centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 1000 giri/min per cinque minuti.

Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in quattro millilitri di buffer di lisi con inibitori delle proteasi come descritto nel protocollo scritto. Successivamente, trasferire le cellule con una pipetta in un omogenizzatore con pestello tipo B e omogeneizzare con 20 movimenti su ghiaccio. Quindi trasferire l'omogenato in un tubo da centrifuga posto su ghiaccio.

Centrifugare il campione a 2000 G per 10 minuti, a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante, che contiene il materiale citoplasmatico e il resus.

Sospendere il pellet in due millilitri di tampone di lavaggio freddo C contenente inibitori delle proteasi; sovrapporre delicatamente il materiale risospeso su un cuscino di cinque millilitri di saccarosio al 30% in una provetta da centrifuga fredda. Per isolare i nuclei, centrifugare a 2.400 ×g per cinque minuti in un rotore con becchi oscillanti: i nuclei migreranno attraverso il cuscino mentre i detriti cellulari rimarranno all'interfaccia. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione tutto il volume liquido e risospendere i nuclei in 250 microlitri di tampone di lavaggio freddo C con inibitori delle proteasi; trasferire quindi i nuclei in una microprovetta da 1,5 millilitri.

Per iniziare l'isolamento dei nucleosomi, aggiungere tre microlitri di cloruro di calcio 0,1 molare ai nuclei e posizionare in un blocco termico a 37 gradi Celsius fino al raggiungimento dell'equilibrio termico. Quindi aggiungere due unità di micrococcal nuclease in 10 microlitri di buffer per micrococcal nuclease e incubare per 12 minuti a 37 gradi Celsius. Mescolare frequentemente con la punta di una pipetta.

Dopo l'incubazione, fermare la reazione con sei microlitri di E-D-T-A di sodio 0,5 molarità a P-H 8 e porre sul ghiaccio per raffreddare. Successivamente, centrifugare il campione a 2000 ×g per quattro minuti; al termine della centrifugazione, scartare il soprannatante e risospendere il pellet in 300 microlitri di EDTA di sodio 0,2 millimolare. Incubare il campione sul ghiaccio per un'ora, mescolando occasionalmente con pipettatura delicata.

Dopo una centrifugazione a 3000 G per quattro minuti, a quattro gradi Celsius, raccogliere il soprannatante, che contiene i nucleosomi liberi, in un nuovo tubo Eppendorf e conservarlo sul ghiaccio per un ulteriore utilizzo dei nucleosomi. Sospendere il pellet in 300 microlitri di EDTA sodico 0,2 millimolare come in precedenza e incubare sul ghiaccio per un'ora con mescolamento delicato occasionale.

Dopo l'incubazione, centrifugare il campione. Nuovamente, combinare il surnatante risultante con il campione rimanente nel tubo microcentrifuga posto sul ghiaccio. Per iniziare il saggio nucleosoma Eliza, caricare una piastra Eliza a 96 pozzetti con una serie discendente di cinque diluizioni seriali due volte consecutive di nucleosomi e tampone di rivestimento, partendo da 0,1 microgrammi per 50 microlitri nel pozzetto superiore; ogni serie di diluizioni deve essere caricata in triplice replicato.

Ricordarsi di includere pozzetti con solo tampone di rivestimento come controlli. Incubare la piastra durante la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Utilizzare un lavatore di piastre per lavare le piastre con 200 microlitri per pozzetto di PBS al 0,5% tra 20 a temperatura ambiente, quattro volte per un totale complessivo di 10 minuti.

Ora aggiungere 100 microlitri per pozzetto di soluzione bloccante e incubare per un'ora a temperatura ambiente su un agitatore rotante. Al termine dell'incubazione, rimuovere il buffer bloccante scuotendo energeticamente la piastra capovolta sopra un lavandino. Successivamente, aggiungere l'anticorpo primario diluito in un volume di 50 microlitri per pozzetto in una soluzione di 5% PSA in 0,05% tra 20 in PBS e incubare la soluzione per un'ora su un agitatore rotante a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione con l'anticorpo primario, lavare le piastre come in precedenza utilizzando il lavapiastre. Al termine della procedura di lavaggio, aggiungere 50 microlitri per pozzetto di anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano, diluito in PBS con 5% BSA e 0,5% Tween 20, e incubare a temperatura ambiente per un'ora su un agitatore rotante. Dopo l'incubazione con l'anticorpo secondario, lavare nuovamente le piastre come in precedenza.

Utilizzare il lavatore di piastre per sviluppare la piastra. Aggiungere 50 microlitri di substrato TMB Eliza in ogni pozzetto e incubare per 10 minuti. A temperatura ambiente, i pozzetti della piastra ELIZA diventeranno blu e l'intensità sarà proporzionale alla quantità di modifiche dei nucleosomi presenti in ciascuno di essi.

Bene, quindi arrestare la reazione aggiungendo 50 microlitri per pozzetto di acido solforico 2 N. Il colore diventerà marrone; centrifugare la piastra a 1500 giri al minuto per due minuti per eliminare eventuali bolle d'aria.

La piastra è ora pronta per la quantificazione su un lettore di piastre colorimetrico. Infine, leggere la piastra a 450 nanometri ed esportare i risultati per l'analisi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se effettuata correttamente dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sulle cellule staminali per esplorare le risposte epigenetiche agli eventi di differenziamento e riprogrammazione a livello dell'intero epiproteoma.