Conteggio cellule staminali neuronali

Ora vi mostrerò come contare le cellule neuro precursori umane e voi contereste le vostre cellule quando vorreste metterle per l'immunochimica o quando vorreste fare una trasfezione con la macchina dei fattori nucleari. Uso un emocitometro a contrasto di fase che ha una griglia di bordi e usiamo anche un colorante chiamato trip e blue. E il colorante è utile in quanto può distinguere tra cellule vive e morte.

Le cellule morte o morenti assorbono questo colorante e appaiono blu. Quando si guardano le cellule nell'emo, il citometro e le cellule vive sono in grado di escludere questo colorante e non appaiono blu. In questo modo è possibile determinare la vitalità delle cellule per preparare una soluzione di trip e blu e media.

Aggiungerò 20 microlitri di trappola e soluzione blu in questo tubo epi da 0,5 mil. E poi aggiungerò 25 microlitri di supporto. In questo modo in questo momento ho 45 microlitri di una trappola blu e una soluzione di terreno in modo che quando aggiungo cinque microlitri di sospensione cellulare, avrò una diluizione da uno a 10.

E quindi ora aggiungerò cinque microlitri di sospensione cellulare. Per prima cosa mi assicurerò che le cellule siano ben risospese con il vortice delle dita. Quindi ora voglio assicurarmi che questa soluzione sia ben miscelata.

Quindi metterò il letto su e giù un paio di volte. E infine caricherò circa 12 microlitri di questa sospensione cellulare in un emocitometro. Ha, ha due porte e puoi, puoi usare una delle due.

Quindi tutto quello che devi fare è introdurre la soluzione in questa porta e il liquido verrà aspirato da un'azione capillare. E ora sono pronto a contare. Ecco uno sguardo all'emocitometro a 10 x e qui abbiamo un quadrante che contiene 16 quadrati.

E come potete vedere, qui possiamo osservare cellule vive e morte. Qui abbiamo cellule vive come questa e questa e questa. E abbiamo anche alcune cellule morte come questa.

Se ci fai caso, la cellula morta appare blu scuro, mentre le cellule vive hanno una sorta di grandine intorno a loro. Quindi ora conterò tutte le cellule vive. Quindi andrò da sinistra a destra e dall'alto verso il basso.

1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Quindi abbiamo tre sei celle in totale in questo quadrante. Quindi, quando vedo le celle che si trovano sul bordo del quadrante, come lungo questa linea qui, per essere coerenti, conto le celle che si trovano sul bordo sinistro e sul bordo superiore.

E conto costantemente le cellule su quei bordi per tutti i quadranti dell'emocitometro. Quindi ora calcoleremo quante cellule abbiamo per microlitro. E per fare ciò prenderò la media delle celle per quadrante, che è 38 e moltiplicherò per 10, che è un fattore determinato dalle dimensioni della camera.

E moltiplicheremo anche per 10, che in questo caso è il nostro fattore di diluizione. E alla fine, otterremo il numero di cellule per microlitro. Quindi in questo caso abbiamo 3.800 cellule per microlitro.

E poiché abbiamo sospeso il nostro pallet di celle in 500 microlitri di soluzione, è possibile calcolare quante celle si hanno in totale. E siamo tutti pronti.