Name: Conteggio cellule staminali neuronali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Impara a contare le cellule staminali neurali umane (hNSPCs) utilizzando un emocitometro a contrasto di fase e il colorante blu di Tripan. Questo metodo permette di distinguere efficacemente le cellule vive da quelle morte per applicazioni di coltura tissutale.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Philip H. Schwartz del National Human Resource neurale delle cellule staminali presso l&#39;Ospedale dei Bambini s, Orange County Istituto di Ricerca per la fornitura di culture hNSPC.

Passaging cellule staminali neuronali Nota: Si prega di fare riferimento al <a href="/index/details.stp?ID=263">Passaging Cellule staminali neurali umane</a> articolo su come staccare e risospendere le cellule. https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 Preparazione della sospensione cellulare di conteggio <ol><li> Mettere 25 ml di soluzione 0,4% Tricloroetano e 20 l di media cellule in una provetta Eppendorf. </li><li> Risospendere le cellule da contare picchiettando delicatamente la provetta contenente le cellule in un volume noto di media per creare una sospensione omogenea. Mettere 5 ml di cellule nel tubo eppendorf dal passaggio precedente. Questo passo diluisce la concentrazione cellulare di un fattore 10. </li><li> Posizionare il vetro di copertura sul emocitometro e caricare circa 11-12 ml di sospensione cellulare. <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_4/262_Figure-01.png" alt="262_Figure-01" width="511" height="139"> </li></ol> Conteggio delle cellule nel emocitometro <ol><li> Osservare l'intera griglia dei emocitometro in un microscopio a contrasto di fase. Focus su un quadrante della griglia (come quello in rosso). <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_5/262_Figure-02.png" alt="262_Figure-02" width="492" height="278"> </li><li> Le cellule morte o morenti apparirà azzurro perché la loro membrana è stato danneggiato e non sono in grado di escludere il colorante Blu tripano. Cellule vitali non appare blu e sarà circondato da un "alone" di luce in contrasto di fase (sarà "fase luminosa"). </li><li> Contare il numero di cellule vitali in un quadrante (area 1 mm 2). È inoltre possibile determinare la vitalità cellulare dividendo il numero di cellule vitali per il numero totale delle cellule. Contare le celle in 3-4 quadranti casuale e determinare il numero medio di cellule per ogni quadrante. Poiché il volume di un quadrante è noto per essere da 10 ml -4 o 0,1 microlitri, la concentrazione di cellule può essere determinata <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_6/262_Figure-03.png" alt="262_Figure-03" width="741" height="165"> </li><li> È possibile utilizzare il collegamento seguente per determinare il # cellule / ml: <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_7/262_Figure-04.png" alt="262_Figure-04" width="368" height="69"> # Totale di cellule in provetta le cellule = # / X microlitri microlitri in tubo </li></ol>

<ol><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+Hemacytometer%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Using a Hemacytometer.</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3</a> (2008).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Chamber+%28Hemacytometer%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Counting Chamber (Hemacytometer).</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
</a> (2008).</li>
</ol>

Questo protocollo descrive un modo semplice e rapido per determinare la concentrazione cellulare per una serie di esperimenti che coinvolgono le cellule. Usando la scorciatoia descritti in 3d, si può rapidamente e con precisione determinare la concentrazione cellulare ed il numero totale di cellule in un dato volume.

<table><tbody><tr><td>Emocitometro a Contrasto di Fase</td><td>Strumento</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>Distribuito da Fisher con il numero di catalogo indicato</td></tr><tr><td>Colorante Blu di Trypan 0,4%</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Distribuito da Invitrogen con il numero di catalogo indicato</td></tr></tbody></table>

conteggio cellule staminali neuronali

Counting Human Neural Stem Cells

Conoscenza del numero esatto di cellule vitali in un dato volume di una sospensione cellulare è richiesto per molte manipolazioni di routine di coltura, come le cellule placcatura per immunocitochimica o per transfezione delle cellule. Questo protocollo descrive un metodo semplice e veloce per la differenziazione tra cellule vive e morte e quantificare la concentrazione delle cellule e il numero totale di cellule utilizzando un emocitometro. Questa procedura richiede in primo distacco delle cellule da una superficie di crescita e risospendere in media. Successivamente, le cellule sono diluiti in una soluzione di Blu tripano (idealmente ad una concentrazione che darà 20-50 cellule per quadrante) e collocato nella emocitometro. Infine, la media dei conteggi di cellule vitali in diversi quadranti selezionati in modo casuale, dividendo la media per il volume di un 1 mm 2 quadranti (0,1 mL) e moltiplicando per il fattore di diluizione fornisce il numero di cellule per l. Moltiplicando questa concentrazione di cellule per il volume totale in microlitri dà il numero totale delle cellule. Questo protocollo descrive il conteggio umano neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs), ma può anche essere usato per molti altri tipi di cellule.

Conoscenza del numero esatto di cellule vitali è necessaria per manipolazioni molte colture di tessuti. Questo protocollo descrive come distinguere tra cellule vive e morte e quantificare le cellule utilizzando un emocitometro. Anche se descrive il conteggio umano neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs), può essere utilizzato per altri tipi di cellule.

Conteggio cellule staminali neuronali

La conoscenza del numero esatto di cellule vitali in un dato volume di una sospensione cellulare è necessaria per molte manipolazioni di routine della coltura tissutale, come...

Ora vi mostrerò come contare le cellule precursori neurali umane. Si contano le cellule quando si desidera utilizzarle per l'immunochimica o quando si intende eseguire una trasfezione con il macchinario del fattore nucleare. Utilizzo un emocitometro a contrasto di fase dotato di una griglia perimetrale e impiego anche un colorante chiamato trip blue. Questo colorante è utile perché permette di distinguere tra cellule vive e morte.Le cellule morte o morenti assorbono questo colorante e appaiono blu. Quando si osservano le cellule al citometro ematico, le cellule vive sono in grado di escludere questo colorante e, quindi, non appaiono blu. In questo modo è possibile determinare la vitalità delle proprie cellule per preparare una soluzione di trip, blu e mezzo di coltura.Aggiungerò 20 microlitri di soluzione di trappola e blu in questa provetta eppendorf da 0,5 ml. Successivamente aggiungerò 25 microlitri di mezzo. In questo modo, al momento avrò 45 microlitri di una soluzione di trappola, blu di pan e mezzo, in modo che quando aggiungerò 5 microlitri di sospensione cellulare, otterrò una diluizione 1:10.E ora aggiungerò cinque microlitri di sospensione cellulare. Per prima cosa, veri

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L'introduzione di un gene di interesse in una cellula è un metodo potente per chiarire la sua funzione in vivo. Questo protocollo descrive un metodo efficace di trasfezione di una cultura dei diritti umani neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs) con l'apparecchiatura di Nucleofector elettroporazione fatta da Amaxa.

Trasfezione delle cellule staminali neuronali con il Nucleofector Amaxa

La capacità di manipolare le staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs) in vitro permette di indagare la loro utilità come i trapianti di cellule a fini terapeutici e di esplorare lo sviluppo umano neurale. Questo protocollo presenta un metodo di coltura e hNSPCs passaging nella speranza di aumentare la riproducibilità della ricerca sulle cellule staminali.

Passaging cellule staminali neuronali

Immunocitochimica è un potente metodo per determinare la presenza, localizzazione subcellulare e l'abbondanza relativa di un antigene di interesse in cellule in coltura. Questo protocollo presenta un facile da seguire serie di passaggi che permettono di conservare gli anticorpi e ottenere il massimo della propria colorazione.

Immunocitochimica: cellule staminali neuronali

Questo protocollo video viene illustrato come discriminare ed enumerare in buona fede le cellule staminali neurali in una popolazione mista di cellule precursori neurali utilizzando il neurali che formano colonie test cell.

Neural-formanti colonia saggio Cell: un test per discriminare Bona Fide cellule staminali neurali da cellule progenitrici neurali

Un metodo semplice e affidabile sulle isolamento e la coltura di cellule staminali neurali da scartati tessuto fetale umano corticale è descritto. Culture derivati ​​da noti disturbi neurologici umano può essere utilizzato per la caratterizzazione di processi patologici cellulari e molecolari, oltre a fornire una piattaforma per valutare l'efficacia farmacologica.

Generazione di cellule staminali neurali da scartate tessuto fetale umano corticale

Cellule staminali neurali raccolte dal cervello adulto sono in aumento utilizzati in applicazioni che vanno dalla ricerca di base dello sviluppo del sistema nervoso ad esplorare potenziali applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Questo rende rigoroso controllo delle condizioni di isolamento e di coltura utilizzate per coltivare queste cellule fondamentali per suonare i risultati sperimentali.

Crescere cellule staminali neurali da Regioni convenzionali e non convenzionali del cervello adulto Roditore

Questo protocollo descrive un metodo tagliere meccanico romanzo che consente l'espansione di staminali e cellule progenitrici aggregati sferici neurali senza dissociazione di una sospensione di cellule singole. Mantenere il contatto cellula / cellula consente una crescita rapida e stabile per oltre 40 passaggi.

Un metodo di espansione cGMP-applicabile per Aggregati di neurali umane staminali e cellule progenitrici derivate da cellule staminali pluripotenti o fetale tessuto cerebrale

Un metodo è stato sviluppato per derivare direttamente le cellule staminali neurali umane da cellule progenitrici ematopoietiche arricchite da cellule del sangue periferico.

Induzione diretta di cellule staminali neurali umane da cellule periferiche del sangue emopoietiche progenitrici

Con l'intento di caratterizzare i cambiamenti nei miRNA su cellule staminali neurali umane differenziate (hNSC), descriviamo la differenziazione delle hNSC su un sistema tridimensionale, la valutazione dei cambiamenti nell'espressione dei microRNA mediante array PCR di miRNA e l'analisi computazionale per la previsione del bersaglio dei miRNA e la sua convalida mediante doppio saggio della luciferasi.

Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

Il midollo spinale adulto dei mammiferi contiene cellule staminali/progenitrici neurali (NSPC) che possono essere isolate ed espanse in coltura. Questo protocollo descrive la raccolta, l'isolamento, la coltura e il passaggio di NSPC generate dalla regione periventricolare del midollo spinale adulto dal ratto e da donatori di trapianto di organi umani.

Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano

Le cellule staminali neurali (NSC) si riferiscono alle cellule che possono auto-rinnovarsi e di differenziarsi in tre linee neurali. Qui, descriviamo un protocollo per determinare la frequenza NSC in una data popolazione di cellule utilizzando neurosfere formazione e la differenziazione in condizioni clonali.

Conteggio di cellule staminali neurali L&#39;utilizzo clonali Assays

Impara a contare le cellule staminali neurali umane (hNSPCs) utilizzando un emocitometro a contrasto di fase e il colorante blu di Tripan. Questo metodo permette di distinguere efficacemente le cellule vive da quelle morte per applicazioni di coltura tissutale.

Conteggio cellule staminali neuronali

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