Induzione diretta di cellule staminali neurali umane da cellule periferiche del sangue emopoietiche progenitrici

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre direttamente le cellule staminali neurali dalle cellule del sangue. Ciò si ottiene arricchendo prima le cellule progenitrici ematopoietiche positive CD 34 dal sangue. Il secondo passo consiste nel trasfettare le cellule CD 34 con il virus sendi contenente fattori trascrizionali.

Successivamente, le cellule staminali neurali vengono derivate utilizzando un mezzo selettivo. Il passo finale consiste nel differenziare le cellule staminali neurali indotte in neuroni, astroglia e oligodendrociti. In definitiva, la microscopia a immunofluorescenza viene utilizzata per caratterizzare le cellule risultanti.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente, come la durata dei neuroni direttamente dai fibroblasti, anche la generazione di IPS, è che questo metodo bypassa il noioso processo di generazione e calcolo degli IPS, ma fornisce comunque una grande quantità di cellule neuronali che possono relazionarsi, differenziarsi ai neuroni. Ho avuto l'idea di questo metodo quando ho notato che le cellule CT 34 trasfettate attaccate in realtà sono molto simili alle cellule neuro progeniche primarie in coltura, dimostrando che la procedura sarà Marines, un tecnico della mia vita. Dopo aver isolato le cellule CD 34 dalle cellule mononucleate del sangue periferico secondo le istruzioni del protocollo di testo, iniziare il processo di coltura delle cellule CD 34 mediante Resus, sospendendo le cellule CD 34 in terreno CD 34, quindi seminare le cellule in una piastra a 24 pozzetti a tre volte 10 al quinto pozzetto in un millilitro di terreno.

Dopo l'incubazione per 24 ore in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica, raccogliere le cellule galleggianti e centrifugare la sospensione cellulare a 110 volte G a temperatura ambiente. Quindi scartare il surnatante e risospendere le cellule nel terreno di mantenimento CD 34 fresco. Guarda una nuova piastra da 24 pozzetti in una volta da 10 a una quinta cellula per pozzetto in un millilitro di terreno, incuba a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica per altri cinque giorni, sostituendo metà del terreno a giorni alterni.

Aspirando con cura la metà superiore del surnatante mentre le cellule CD 34 si trovano sul fondo dei pozzetti, come mostrato qui il quinto giorno. Dopo la piastratura, raccogliere le cellule CD 34 e centrifugare le cellule a 170 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente, scartare il surnatante, risospendere le cellule come prima e seminare una nuova piastra a 24 pozzetti in una volta da 10 a 5 cellule per pozzetto in un millilitro di terreno. Quindi scongelare un kit di riprogrammazione IPS Sendi cyto tune.

Immergendo prima il fondo dei tubi in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 10 secondi e poi scongelando completamente a temperatura ambiente. Centrifugare brevemente le provette e metterle sul ghiaccio. Preparare la miscela di virus Sendai mescolando il volume raccomandato di ciascun virus elencato nel certificato di analisi per il lotto corrispondente.

Si raccomanda una molteplicità di infezioni di 15. Aggiungere la miscela di virus Sendai a ciascun pozzetto di cellule CD 34. Quindi mescolare i pozzetti agitando delicatamente la piastra.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica dopo 24 ore. Osservare l'efficienza di trasduzione. Si noti che gli aggregati cellulari e le sfere come quelle mostrate qui sono indicatori di trasduzione riuscita.

Quindi incubare le cellule nell'incubatore di coltura tissutale per cinque-sette giorni fino a quando le cellule attaccate compaiono e raggiungono il 30-50% di confluenza, come mostrato qui a giorni alterni. Cambiare metà del terreno trasferendo con cura la metà superiore del terreno in un altro pozzetto. Se le sfere cellulari vengono trasferite al nuovo, aggiungere una quantità uguale di terreno fresco.

Controllare la cofluenza delle cellule utilizzando il microscopio invertito. Quando le cellule sono confluenti dal 30 al 50%, aspirare il surnatante e riservare e quindi aggiungere un millilitro di terreno progenitore neurale a ciascun pozzetto per creare una piastra di backup utilizzando le sfere nella centrifuga del surnatante, il surnatante di riserva a 170 volte G per 10 minuti. Quindi aspirare il surnatante e risospendere il pellet in una piastra media progenitrice neurale in una piastra a 24 pozzetti rivestita di matrigel.

Come prima, cambiare il mezzo in ogni piastra di celle a giorni alterni fino a quando le celle raggiungono il 60-80% di confluenza. Di solito dopo una settimana. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza richiesta, aspirare il surnatante e aggiungere un millilitro di terreno di cellule staminali neurali a ciascuna.

Bene, quindi dissociare le cellule utilizzando un raschietto cellulare, seguito da un pipettaggio molto delicato. Quindi, trasferire le celle da un pozzetto della piastra a 24 pozzetti in un pozzetto di un sei. Pozzetto piastra.

Aggiungere un altro millilitro di terreno al pozzetto e, dopo aver ripetuto la procedura per tutti i pozzetti, posizionare la piastra a sei pozzetti nell'incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica. Cambia l'intero volume del terreno a giorni alterni fino a quando le cellule raggiungono il 60% di confluenza, dopodiché il tempo si dissocia e reflaziona le cellule in un rapporto da uno a tre, come appena dimostrato per congelare una porzione di cellule staminali neurali indifferenziate. Per prima cosa, prepara il terreno di congelamento delle cellule staminali aggiungendo il 20% di ossido di dimetilsolfo o DMSO al terreno delle cellule staminali neurali e mettilo sul ghiaccio.

Quindi dissociare le cellule nella piastra a sei pozzetti. Utilizzando un raschietto cellulare e un pipettaggio delicato. Riservare un'aliquota della sospensione per la conta delle cellule e quindi centrifugare le cellule a 170 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente mentre le cellule girano, contare le cellule nell'aliquota della sospensione utilizzando un emometro, un citometro o un contatore automatico di cellule e calcolare il volume di terreno necessario per ottenere una concentrazione di una volta 10 per le sei cellule per millilitro.

Al termine della centrifuga, scartare il surnatante e risospendere il pellet nel mezzo delle cellule staminali neurali in una volta da 10 a sei cellule per millilitro. Quindi aggiungere un volume uguale di pipetta di terreno di congelamento cinque volte 10 alla quinta cellula in un volume di un millilitro in una fiala criogenica e congelare le cellule in un contenitore di congelamento secondo le istruzioni del produttore. Quando le cellule staminali neurali nella piastra a sei pozzetti raggiungono l'80% di confluenza, staccarle utilizzando un poliziotto di gomma e quindi dissociarle mediante pipettaggio delicato.

Raggruppare la sospensione cellulare in una provetta sterile. Contare le cellule utilizzando un emometro, un citometro o un contatore di cellule automatizzato e regolare la concentrazione della sospensione cellulare a una volta da 10 a una quinta cellula per millilitro con terreno di cellule staminali neurali. Quindi pipettare un millilitro della sospensione cellulare su un vetrino coprinte rivestito di poli-D lisina e laminato in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti dopo aver ripetuto la procedura per il numero di pozzetti desiderato.

Incubare come prima per 24 ore. Trascorso il tempo di incubazione, aspirare il terreno e sostituirlo con la differenziazione neurale. Incubazione del terreno per due settimane a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, cambiando il terreno due volte a settimana dopo due settimane.

Le cellule staminali neuronali dovrebbero essere completamente differenziate, come mostrato qui, e pronte per applicazioni a valle come la colorazione in immunofluorescenza. Le prime due immagini mostrano che le cellule staminali neurali esprimono nido in e SOX due. Mentre la terza immagine dimostra che l'OCT quattro non è espresso, DPI viene utilizzato come marcatore nucleare e la barra della scala rappresenta 200 micron.

Dopo aver seguito il protocollo di differenziazione delineato nel video, i neuroni differenziati esprimono il marcatore neuronale beta tre tubulina. Le cellule staminali neurali umane possono anche essere differenziate in cellule gliali. Quando differenziate in astrociti, le cellule esprimono il marcatore astrocitario GFAP.

Infine, in questa immagine, le cellule sono state differenziate in oligodendrociti ed esprimono il marcatore degli oligodendrociti. O quattro. Una volta padroneggiata, la generazione di cellule staminali neurali umane indotte dal sangue periferico può essere effettuata in circa tre settimane.

Se eseguite correttamente, le cellule staminali neuro potrebbero essere neuroni ulteriormente differenziati e poco chiaro il metodo è i lunghi e complicati processi di generazione IPS e potrebbe essere un'opzione facile per generare colture neuronali specifiche per il paziente dopo il suo sviluppo. Questo percorso tecnico consente ai ricercatori nel campo delle neuroscienze di esplorare la modellazione di colture cellulari individuali per vari disturbi neurologici, che potrebbero rappresentare meglio le differenze genetiche in disturbi specifici, in particolare da campioni di singoli pazienti.