Name: Induzione diretta di cellule staminali neurali umane da cellule periferiche del sangue emopoietiche progenitrici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Scopri come indurre cellule staminali neurali umane direttamente da cellule progenitrici emopoietiche CD34+ del sangue periferico. Questo metodo innovativo bypassa la generazione di iPSC e offre una fonte accessibile di neuroni per la ricerca sulle malattie neurologiche.

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

1. Arricchimento di emopoietiche progenitrici cellule da sangue intero per adulti NOTA: le cellule progenitrici ematopoietiche o cellule CD34 + possono essere purificati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) derivate da una varietà di fonti, tra cui il sangue del cordone, materiale leucaferesi e sangue intero con metodi basati gradiente di densità di centrifugazione. Il metodo qui elencati utilizza sangue intero come esempio. <ol><li> Isolamento di PBMC da sangue intero: <ol><li> Aggiungere 4,5 ml di mezzo di separazione dei linfociti al tubo SepMate pipettando attraverso il foro centrale dell&#39;inserto. </li><li> Diluire il campione di sangue con un uguale volume di DPBS sterili contenenti siero umano 2% (v / v). Ad esempio, diluire 5 ml di campione con 5 ml di siero umano DPBS + 2%. </li><li> Aggiungere il campione diluito pipettando giù il lato del tubo. Fare attenzione a non versare il campione direttamente attraverso il foro centrale. </li><li> Centrifugare a 1200 xg per 10 minuti a RT. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante sopra il livello PMBC. </li><li> Raccogliere lo strato PBMC (nuvoloso) in un nuovo tubo. </li><li> Aggiungere 15 ml di fosfato di Dulbecco tamponata Saline (DPBS) contenente siero umano 2% nel tubo e centrifugare a 150 xg per 10 min a RT con il freno off. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 15 ml di DPBS contenente siero umano 2%. Contare il numero di cellule. </li><li> Centrifugare a 690 xg per 10 min a RT. Rimuovere tutto il surnatante dal tubo. </li><li> Risospendere le cellule a 1 x 10 7 cellule per 15 ml di medium (IMDM) Dulbecco modificato di Iscove contenente 1% di antibiotici (v / v) e siero umano al 10% (v / v). </li><li> Incubare le cellule O / N a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore prima isolare cellule CD34 +. </li></ol></li><li> Selezione positiva di cellule CD34 + da PBMC utilizzando CD34 Multisort Kit: NOTA: lavoro veloce e utilizzare soluzioni pre-raffreddato a rendere le cellule freddo e prevenire tappaturadi anticorpi sulla superficie cellulare e l&#39;etichettatura di cellule non-specifico per l&#39;istruzione kit. <ol><li> Raccogliere tutti PMBCs in un tubo da 50 ml e contare il numero di cellule totali nel mezzo. </li><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min. Rimuovere completamente tutto il surnatante. </li><li> Risospendere 8 fino a 10 300 cellule per ml in tampone tallone (DPBS contenente 0,5% di siero umano (v / v) e 2 mM EDTA). </li><li> Aggiungere 100 ml di FcR reagente di bloccaggio e aggiungere 100 ml di MultiSortMicroBeads CD34. </li><li> Mescolare bene e incubare per 30 minuti in frigorifero (2 - 8 ° C). </li><li> Lavare le cellule aggiungendo 2 ml di tampone per tallone 10 8 cellule e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT. Rimuovere completamente il surnatante. </li><li> Risospendere fino a 10 8 cellule in 500 microlitri di tampone. </li><li> Inserire colonna MACS LS nel campo magnetico di un separatore MACS e preparare colonna risciacquando con 3 ml di tampone tallone. </li><li> Applicare sospensione cellulare sul center della colonna. Cellule senza etichetta fluiranno attraverso cui possono essere raccolti, se si preferisce. </li><li> Lavare colonna tre volte con 3 ml di tampone tallone. </li><li> Rimuovere la colonna dal separatore e posizionarlo su un tubo 15 ml. </li><li> Aggiungere 5 ml di tampone tallone nella colonna e lavare immediatamente le cellule marcate magneticamente spingendo lo stantuffo nella colonna. </li><li> Aggiungere 20 ml di MULTISORT Reagente di uscita per 1 ml di sospensione cellulare. Mescolare bene e incubare per 10 minuti in frigorifero (2 - 8 ° C). </li><li> Aggiungere 1 - 2 ml di tampone tallone per 10 7 cellule e centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a RT. Rimuovere completamente il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 50 ml di tampone tallone per 10 7 cellule. </li><li> Aggiungere 30 ml di MULTISORT arresto reagente per 10 7 cellule e incubare per 15 minuti in frigorifero. </li><li> Aggiungere 5 ml di tampone tallone e centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a RT. Scartare il surnatante. </li></ol></li></ol> 2. Derivazione di cellule staminali neurali indotte da cellule CD34 + <ol><li> Cellule CD34 + cultura: NOTA: media appena preparato deve essere utilizzato entro 7 giorni se conservata in frigorifero. Significativa perdita di cellule CD34 può essere osservata dopo 24 ore, ma la significativa proliferazione delle cellule dovrebbe essere evidente, soprattutto dopo giorno 5. Se il numero di cellule diminuisce continuamente o non c&#39;è proliferazione, esso implica o cattiva qualità delle cellule medie o CD34 e cellule non deve essere utilizzato per il passo successivo. <ol><li> Risospendere e cultura CD34 + cellule CD34 mantenendo medio (StemSpan SFEM terreno contenente trombopoietina umana (TPO, 100 ng / ml), FMS-come tirosin chinasi 3 (Flt-3) ligando (100 ng / ml) e fattore delle cellule staminali (SCF, 100 ng / ml), interleuchina-6 (IL-6, 20 ng / ml) e interleuchina-7 (IL-7, 20 ng / ml)) in una piastra a 24 pozzetti (fino a 3 x 10 5 / pozzetto in 1 ml di terreno per pozzetto) a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. </li><li> After 24 ore, raccogliere le cellule galleggianti e centrifugare le cellule a 110 xg a temperatura ambiente per eliminare eventuali cellule collegate e detriti cellulari. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 1 ml di CD34 mantenere fresco medio e seme in una nuova piastra 24 pozzetti (fino a 1 x 10 5 / pozzetto) a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore per 5 giorni aggiuntivi. </li><li> Sostituire la metà del mezzo ogni l&#39;altro giorno aspirando accuratamente la metà superiore surnatante mentre le cellule CD34 + sono galleggianti sul fondo dei pozzetti (Figura 1A). </li></ol></li><li> Sendai trasfezione virus: <ol><li> Il giorno 5, raccogliere le cellule CD34 e centrifugare le cellule a 170 xg per 10 min a RT. Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in terreno fresco a 1 x 10 5 / pozzetto in una piastra da 24 pozzetti in 1 ml di terreno. </li><li> Scongelare un kit riprogrammazione cytotune-iPS Sendai dapprima immergendo il fondo dei tubi in un bagno di 37 ° C l&#39;acqua per 10 secondi e poi completamente scongelare unt RT. Brevemente centrifugare le provette e metterli su ghiaccio. Preparare l&#39;impasto Sendai miscelando il volume consigliato di ogni virus elencati sul certificato di analisi (COA) per il lotto corrispondente. MOI 15 è raccomandato. </li><li> Aggiungere mix Sendai a ciascun pozzetto di cellule CD34. Mescolare i pozzetti scuotendo delicatamente. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. </li><li> Osservare l&#39;efficienza di trasfezione dopo 24 ore. Si noti che aggregati di cellule e la formazione sfera sono indicatori per trasfezione di successo (Figura 1B). </li><li> Cambiare la metà del mezzo trasferendo accuratamente la metà superiore del mezzo ad un altro bene. Se ci sono sfere cellule nel nuovo pozzo, aggiungere la stessa quantità di mezzo fresco. </li><li> Modificare media ogni l&#39;altro giorno ripetendo il passaggio 2.2.6. </li></ol></li><li> Induzione di cellule staminali neurali: NOTA: A seconda delle condizioni delle cellule, circa 5 o 7 giorni dopo la trasfezione, le cellule aderenti monostrato raggiungeranno 30 -50% di confluenza (Figura 1C). <ol><li> Rimuovere il surnatante contenenti celle galleggianti e sfere e quindi aggiungere 1 ml di terreno progenitrici neurali (Dulbecco Modified Eagle Medium: miscela di nutrienti F-12 (DMEM / F12), contenente 1x N2 supplemento, 0,1% (w / v) di albumina sierica bovina ( BSA), 1% (v / v) antibiotici, 20 ng / ml di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) e 20 ng / ml di fattore di crescita epidermico (EGF)) nelle cellule aderenti. </li><li> Facoltativamente, dissociare le sfere cellule pipettando delicatamente e centrifugare le cellule a 170 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno progenitrici neurali in una nuova piastra 24 pozzetti rivestite con matrigel per istruzione come backup. </li><li> Modificare il supporto a giorni fino alle cellule raggiungono 60 - 80% confluenti, di solito dopo 1 settimana. </li><li> Eliminare il surnatante e aggiungere 1 ml di terreno di cellule staminali neurali (media siero libero, NSC SFM). Dissociare il celle utilizzando un raschietto cellulare seguitada molto delicato pipettaggio. </li><li> Rimuovere le cellule e sementi tutti in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Aggiungi un altro 1 ml di mezzo di cellule staminali neurali per fare 2 ml supporto per ciascun bene. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. </li><li> Modificare media ogni l&#39;altro giorno. </li><li> Quando le cellule hanno raggiunto il 60% di confluenza, dissociarsi e replate le cellule a rapporto 1: 3 seguendo la procedura descritta in 2.3.4 e 2.3.6. </li></ol></li><li> Congelamento delle cellule staminali neurali: <ol><li> Preparare cellule staminali neurali congelamento mezzo aggiungendo 20% dimetilsolfossido (DMSO) nel terreno di cellule staminali neurali. Mantenere il mezzo congelamento su ghiaccio. </li><li> Dissociano le cellule in un 6-pozzetti, utilizzando raschietto cella seguita pipettando delicatamente. Contare le cellule. Centrifugare le cellule a 170 xg per 10 min a RT. Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in terreno cellule staminali neurali a 1 x 10 6 / ml. Aggiungere lo stesso volume di congelamento mezzo alle cellule. </li><li> Aggiungere 1 ml (5 x 10 5 cellule totali) di cellule in un esageratamente. Congelare le cellule utilizzando un congelamento contenitore Mr. Froster seguendo le istruzioni. </li></ol></li></ol> 3. Neural differenziazione cellulare <ol><li> Cellule neuronali differenziazione: <ol><li> Quando le cellule staminali neurali raggiungono l&#39;80% di confluenza, staccare le cellule staminali neurali con un poliziotto di gomma e poi dissociarsi pipettando delicatamente. </li><li> Contare le cellule e regolare la concentrazione di 1 x 10 5 / ml in mezzo di cellule staminali neurali. </li><li> Per la differenziazione neuronale, piastra le cellule sulla copertura poli-D-lisina / laminina rivestito scivola in piastre da 24 pozzetti a 1 x 10 5 / bene. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. </li><li> Sostituire il supporto con il mezzo differenziamento neurale (DMEM / F12 contenenti 1x N2 supplemento, 1x B27 supplemento, 300 ng / ml cAMP, 0,2 mm di vitamina C, di 10 ng cervello ml / derived neurotrophic factor (BDNF) e 10 ng / ml cellule gliali derivati fattore neurotrofico (GDNF)) after 24 ore. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. </li><li> Cambiare terreno di differenziamento neurale due volte alla settimana per 2 settimane. </li></ol></li><li> Differenziazione astrogliali: <ol><li> Dissociare le cellule staminali neurali pipettando. </li><li> Contare le cellule e regolare la concentrazione cellulare di 5 x 10 4 cellule / ml. Seme le cellule su piastre da 24 pozzetti. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. </li><li> Sostituire il mezzo con DMEM / F12 con siero fetale bovino 10% (FBS) e incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. </li><li> Cambiare media due volte alla settimana per 2 settimane. Se le cellule raggiungono confluenza prima di 2 settimane replate le cellule seguenti operazioni 3.2.1 e 3.2.2. </li></ol></li><li> Oligodendrocyte differenziazione: <ol><li> Dissociare le cellule staminali neurali pipettando. </li><li> Contare le cellule e di semi 1 x 10 5 cellule in piastre da 24 pozzetti rivestiti di poli-L-Ornitina in 1 ml di oligodendrociti Differentimedia zione costituito da DMEM / F12 contenenti supplemento N2, 10 ng / ml di piastrine derivato fattore di crescita-AA (PDGF-AA), 2 ng / ml di neurotrofina-3 (NT-3), 2 ng / ml di sonic hedgehog ( Shh), e 3 Nm di triiodotironina (T3). Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. </li><li> Cambiare media due volte alla settimana per 2 settimane. </li><li> Sostituire il mezzo con DMEM / F12 con 1xN2 supplemento e 3 Nm di T3 e di cultura le cellule per una settimana supplementare per proteina basica della mielina (MBP) produzione. </li></ol></li></ol> 4. Immunofluorescenza <ol><li> Sostituire media con 4% paraformaldeide (PFA). Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Scartare PFA e lavare con PBS contenente 0,1% Triton X-100 (PBS-T) per 3 volte, 5 min ciascuna volta. </li><li> Permeabilize cellule con PBS contenente 0,5% Triton X-100 per 10 minuti a RT. </li><li> Bloccare le cellule con PBS-T contenente siero di capra 4% per 20 minuti a RT. </li><li> Incubare le cellule con corrispondenti Antibo primariostampi diluito in PBS-T contenente 0,1% BSA per 2 ore a temperatura ambiente o O / N in cella. </li><li> Lavare le cellule per 3 volte con PBS-T, 5 min ciascuna volta. Incubare le cellule con corrispondenti anticorpi secondari accoppiati con un fluorocromo utilizzando 1: 400 di diluizione in PBS-T contenente 0,1% BSA per 1 ora su un agitatore al buio. </li><li> Lavare le cellule con PBS-T contenente 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 10 minuti a RT. </li><li> Lavare le cellule due ulteriori volte con PBS-T per 5 minuti ciascuno a RT. </li><li> Osservare le cellule marcate con un microscopio e scattare foto (figura 3). </li></ol>

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</ol>

Lo studio è finanziato dai fondi intramurali del NIH.

Viene fornito un protocollo dettagliato per generare direttamente le cellule staminali neurali da cellule progenitrici ematopoietiche periferiche. Rispetto alle cellule di fibroblasti, sangue periferico umano è più accessibile. Utilizzando il protocollo presentato, più di 1 x 10 5 cellule progenitrici ematopoietiche o cellule CD34 positive, può essere arricchito da 10 ml di sangue intero. Sebbene contaminazione con piastrine di solito non è evitabile, può essere facilmente ridotto...

In vitro colture neuronali sono state utilizzate come strumento fondamentale per lo studio di malattie neurologiche. Animale primario (principalmente roditori) colture neuronali 1, 2 e linee cellulari neuronali umane derivate da gliomi o altri tumori sono i più comunemente utilizzati in tali studi. Tuttavia, è stato riconosciuto che non vi sono differenze significative tra roditori e cellule umane. Molte scoperte basate su roditori non possono essere tradotti per gli esseri umani. Inoltre, con i rapidi sviluppi l&#39;analisi delle informazioni di massa genomica e la relativamente facile editing gene e sequenziamento dell&#39;intero genoma, la tendenza è sempre più orientata alla scoperta di malattia geni inclini e delineare le loro funzioni e ruoli a malattie specifiche, il che rende i pochi neuronale umana linee cellulari solo hanno limitato l&#39;utilizzo. Teoricamente, colture neuronali primarie umane derivate da campioni di sistema nervoso paziente sono la scelta migliore ma sono impossibili da ottenere; meth quindi alternativaODS sono necessari. Negli ultimi anni, alcuni approcci sono stati perseguiti, con due è il più distinguibili. Dopo lo sviluppo della tecnica di generare cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC) utilizzando il mouse e cellule somatiche umane 3, 4, cellule neurali potrebbe essere ulteriormente differenziate da loro 5-7. Tuttavia, la generazione e la caratterizzazione iPSC richiede intensità di lavoro, le tecniche, e l&#39;ingresso di tempo, a volte anche eccessivamente. Poco dopo, un altro approccio è stato sviluppato per trasformare direttamente le cellule neuronali dalle cellule somatiche 8, 9. Poiché i neuroni risultanti sono non-proliferativa, limita la sua applicazione in studi intensivi e screening di farmaci, che richiede una grande quantità di cellule. Per prendere i vantaggi di entrambe le tecniche, diretta derivazione di cellule staminali neurali / cellule progenitrici a partire da cellule somatiche è stata esplorata da diversi gruppi di 10-12, che bypassa il tedioso processo di generazione iPSC e caratterizzazione, ma comunque provides un numero decente di cellule staminali neurali per dopo differenziamento neurale. Abbiamo precedentemente dimostrato che in seguito all&#39;introduzione dei fattori di trascrizione Yamanaka in cellule progenitrici ematopoietiche, cellule staminali neurali possono essere generati direttamente utilizzando una cellula progenitrice neurale selezionando media 13. Qui riportiamo il metodo in dettaglio.

<table><tbody><tr><td>Terreno di separazione linfocitario</td><td>Lonza</td><td>17-829E</td><td>1x</td></tr><tr><td>SepMate</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15415</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Siero umano</td><td>Invitrogen</td><td>34005-100</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotici</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>1%</td></tr><tr><td>CD34 MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-056-701</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Cellgro</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MACS LS colonna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9650</td><td>1x</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Quality Biologicals</td><td>112-035-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Flt-3</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IPS Sendai Kit di riprogrammazione</td><td>Life Technologies</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fiale</td> <td>CryoTubeThermo</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty contenitore</td><td>Thermo</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12400-024</td><td>1x</td></tr><tr><td>integratore di N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>1x</td></tr><tr><td>albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>A2934</td><td>0,1% (p/v)</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Integratore Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>NSC senza siero medium</td><td>Life Technologies</td><td>A1050901</td><td>1x</td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti rivestiti in poli-D-lisina/laminina</td><td>BD Bioscences</td><td>354087</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A9501</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>Vitamina C</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td>0,2 mM</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>1x</td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>Shh</td><td>Peprotech</td><td>1314-SH/CF</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>3 nM</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Qualità Biologica</td><td>119-069-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>4%</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonale di topo anti-Nestina</td><td>Millipore</td><td>AB5922</td><td>1:1.000 diluizione</td></tr><tr><td>Anti-SOX2 anticorpo</td><td>Cellule staminali applicate</td><td>ASA0120</td><td>Pronto all'uso</td></tr><tr><td>Topo anti-&beta; Anticorpo III-tubulina</td><td>Promega</td><td>G712A</td><td>Diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFAP di coniglio</td><td>Sigma</td><td>G4546</td><td>Diluizione 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-O4</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1326</td><td>IgM; 1 ng/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 capra anticorpo anti-coniglio</td><td>Life techniologies</td><td>A11012</td><td>Diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-topo anticorpo</td><td>Life techniologies</td><td>A11001</td><td>1:400 diluizione</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-topo Anticorpo IgM</td><td>Life techniologies</td><td>A21042</td><td>1:250 diluizione</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 &mu; g/ml</td></tr></tbody></table>

induzione diretta di cellule staminali neurali umane da cellule periferiche del sangue emopoietiche progenitrici

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Malattie umane specifiche colture neuronali sono essenziali per la generazione di modelli in vitro per le malattie neurologiche umane. Tuttavia, la mancanza di accesso alle adulti umano colture neuronali primarie pone sfide uniche. I recenti sviluppi in cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC) fornisce un approccio alternativo per derivare culture neuronali di fibroblasti cutanei attraverso specifico paziente iPSC, ma questo processo è laborioso, richiede competenze specifiche e una grande quantità di risorse, e può richiedere diversi mesi. Ciò impedisce l&#39;ampia applicazione di questa tecnologia per lo studio delle malattie neurologiche. Per superare alcuni di questi problemi, abbiamo sviluppato un metodo per ottenere cellule staminali neurali direttamente dal sangue periferico umano adulto, bypassando il processo di derivazione IPSC. Cellule progenitrici ematopoietiche arricchite da sangue periferico umano adulto sono state coltivate in vitro e trasfettate con vettori Sendai contenenti fattori di trascrizione Sox2, ottobre3/4, Klf4, e c-Myc. I risultati di trasfezione di cambiamenti morfologici nelle cellule che vengono ulteriormente selezionati utilizzando media progenitrici neurali umane contenenti base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) e fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF). Le cellule risultanti sono caratterizzate dall&#39;espressione di marcatori di cellule staminali neuronali, come nestin e SOX2. Queste cellule staminali neurali potrebbero essere ulteriormente differenziati ai neuroni, astroglia e oligodendrociti in mezzi differenziazione specificato. Usando campioni di sangue periferico umano facilmente accessibili, questo metodo potrebbe essere utilizzato per ottenere cellule staminali neurali per un&#39;ulteriore differenziazione di cellule neurali per la modellazione in vitro di disturbi neurologici e può avanzare studi relativi alla patogenesi e il trattamento di queste malattie.

<html> La qualità delle cellule CD34 è critico per il successo di trasduzione di cellule staminali neurali. Cellule CD34 alta qualità proliferano durante il primo paio di giorni di coltura e appaiono come non aderenti, cellule omogeneamente rotonde, galleggiante appena sopra il fondo di recipienti di coltura (Figura 1A). I risultati infettati in aggregati di cellule, che si espande nel tempo (Figura 1B), mentre si possono verificare aggregati cellulari non specifici durante coltura cellu...

Un metodo è stato sviluppato per derivare direttamente le cellule staminali neurali umane da cellule progenitrici ematopoietiche arricchite da cellule del sangue periferico.

Induzione diretta di cellule staminali neurali umane da cellule periferiche del sangue emopoietiche progenitrici

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre direttamente cellule staminali neurali da cellule del sangue. Questo risultato viene ottenuto arricchendo innanzitutto le cellule progenitrici ematopoietiche positive per CD34 ottenute dal sangue. Il secondo passaggio consiste nel trasfettare le cellule CD34 con virus sendai contenente fattori trascrizionali.Successivamente, le cellule staminali neurali vengono ottenute utilizzando un mezzo selettivo. L'ultimo passaggio consiste nel differenziare le cellule staminali neurali indotte in neuroni, astrociti e oligodendrociti. Infine, la microscopia a fluorescenza immunoistochimica viene utilizzata per caratterizzare le cellule ottenute.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la generazione di neuroni direttamente da fibroblasti o la produzione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), consiste nel fatto che questo metodo evita il processo laborioso di generazione e caratterizzazione delle iPS, fornendo comunque una notevole quantità di cellule neuronali capaci di differenziarsi in neuroni. L'idea per questo metodo mi venne per la prima volta quando notai che le cellule CT 34 transfettate e aderenti mostravano un aspetto molto simile a quello delle cellule progenitrici neurali in coltura primaria, dimostrando che la procedura sarebbe stata alla portata di un tecnico come Marines, del mio laboratorio. Dopo aver isolato le cellule CD 34 dai globuli bianchi mononucleati secondo le istruzioni riportate nel protocollo, iniziare il processo di coltura delle cellule CD 34 risospendendo le cellule CD 34 nel mezzo specifico per CD 34 e quindi seminando le cellule in una piastra a 24 pozzetti a una densità di tre volte 10 alla quinta cellule per pozzetto in un millilitro di mezzo.Dopo un'incubazione di 24 ore in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica, raccogliere le cellule in sospensione e centrifugare la sospensione cellulare a 110 ×g a temperatura ambiente. Quindi eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in un mezzo di mantenimento CD34 fresco. Seminare in una nuova piastra a 24 pozzetti a una densità di 1 × 10⁵ cellule per pozzetto in un millilitro di mezzo, incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore con 5% di anidride carbonica per ulteriori cinque giorni, sostituendo metà del mezzo ogni due giorni.Aspirando attentamente la metà superiore del sopranatante mentre le cellule CD34 si trovano sul fondo delle pozzette, come mostrato qui al quinto giorno. Dopo la semina, raccogliere le cellule CD34 e centrifugare le cellule a 170 × g per 10 minuti a temperatura ambiente, scartare il sopranatante, risospendere le cellule come in precedenza e seminare una nuova piastra a 24 pozzette a una concentrazione di 1 × 10⁵ cellule per pozzetta in un millilitro di mezzo. Successivamente, scongelare un kit di riprogrammazione CytoTune iPS Sendai.Immergere prima le estremit&agrave; inferiori delle provette in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 10 secondi e quindi scongelare completamente a temperatura ambiente. Centrifugare brevemente le provette e posizionarle sul ghiaccio. Preparare la miscela di virus della peste dei topi mescolando il volume raccomandato di ciascun virus indicato sul certificato di analisi per il lotto corrispondente.Si raccomanda una multiplicità di infezione di 15. Aggiungere la miscela del virus di Sendai in ogni pozzetto contenente cellule CD34. Quindi mescolare i pozzetti agitando delicatamente la piastra.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore con 5% di anidride carbonica dopo 24 ore. Osservare l'efficienza di trasduzione. Notare che gli aggregati cellulari e le sferoidi, come quelli mostrati in questo caso, sono indicatori di una trasduzione riuscita.Quindi incubare le cellule nell'incubatore per colture cellulari per cinque a sette giorni fino a quando le cellule aderenti non appaiono e raggiungono una confluenza del 30-50%, come mostrato qui, ogni due giorni. Cambiare metà del mezzo trasferendo con attenzione la metà superiore del mezzo in un altro pozzetto. Se le sfere cellulari vengono trasferite nel nuovo pozzetto, aggiungere un volume equivalente di mezzo fresco.Verificare la confluenza delle cellule utilizzando il microscopio invertito. Quando le cellule raggiungono una confluenza del 30-50%, aspirare il soprannatante e metterlo da parte, quindi aggiungere un millilitro di mezzo per progenitori neurali in ogni pozzetto per preparare una piastra di riserva utilizzando le sfere presenti nel soprannatante. Centrifugare il soprannatante conservato a 170 × g per 10 minuti. Successivamente, aspirare il soprannatante e risospendere il pellet in mezzo per progenitori neurali, quindi piastrare in una piastra da 24 pozzetti rivestita con matrigel.Come in precedenza, cambiare il mezzo in ogni piastra di cellule ogni due giorni fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza del 60-80%. Di solito dopo una settimana. Una volta raggiunta la confluenza richiesta, aspirare il sopranatante e aggiungere un millilitro di mezzo per cellule staminali neurali a ciascuna piastra.Quindi dissociare le cellule utilizzando una spatola per cellule, seguita da una pipettaggio molto delicato. Successivamente, trasferire le cellule da un pozzetto della piastra a 24 pozzetti a un pozzetto della piastra a sei pozzetti.Aggiungere un altro millilitro di mezzo nel pozzetto e, dopo aver ripetuto la procedura per tutti i pozzetti, posizionare la piastra a sei pozzetti nell'incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Cambiare il volume completo di mezzo ogni due giorni fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza del 60%, momento in cui è necessario dissociare e ripiantare le cellule in un rapporto di uno a tre, come appena illustrato, per congelare una porzione di cellule staminali neurali indifferenziate. Per prima cosa, preparare il mezzo di congelamento per cellule staminali aggiungendo il 20% di dimetilsulfossido o DMSO al mezzo per cellule staminali neurali e porre sul ghiaccio.Quindi dissociare le cellule nella piastra a sei pozzetti, utilizzando una spatola per cellule e pipettaggio delicato. Riservare un'aliquota della sospensione per il conteggio cellulare, quindi centrifugare le cellule a 170 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Mentre le cellule sono in fase di centrifugazione, contare le cellule nell'aliquota della sospensione utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatico e calcolare il volume di mezzo necessario per ottenere una concentrazione cellulare di 1 × 10⁶ cellule per millilitro.Al termine della centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet nel mezzo per cellule staminali neurali a una concentrazione di un milione di cellule per millilitro. Quindi aggiungere un volume uguale di mezzo di congelamento, pipettare cinquecentomila cellule in un volume di un millilitro in una provetta criogenica e congelare le cellule in un contenitore da congelamento seguendo le istruzioni del produttore. Quando le cellule staminali neurali nella piastra a sei pozzetti raggiungono una confluenza dell'80%, staccarle utilizzando un policeman di gomma e quindi dissociarle mediante pipettaggio delicato.Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo sterile. Contare le cellule utilizzando un emo, citometro o un contatore cellulare automatico e regolare la concentrazione della sospensione cellulare a uno per dieci alla quinta cellule per millilitro con mezzo per cellule staminali neurali. Quindi pipettare un millilitro della sospensione cellulare su un cover slip rivestito con poli-D-lisina e laminina in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, ripetendo la procedura per il numero desiderato di pozzetti.Incubare come in precedenza per 24 ore. Trascorso il tempo di incubazione, aspirare il mezzo e sostituirlo con mezzo di differenziamento neurale. Incubare per due settimane a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, cambiando il mezzo due volte alla settimana dopo due settimane.Le cellule staminali neuronali dovrebbero essere completamente differenziate come mostrato qui e pronte per applicazioni successive, come la colorazione mediante immunofluorescenza. Le prime due immagini mostrano che le cellule staminali neurali esprimono nestina e SOX2. Mentre la terza immagine dimostra che OCT4 non è espresso, il DPI viene utilizzato come marcatore nucleare e la barra della scala rappresenta 200 micron.Dopo aver seguito il protocollo di differenziazione descritto nel video, i neuroni differenziati esprimono il marcatore neuronale beta tre tubulina. Le cellule staminali neurali umane possono inoltre essere differenziate in cellule gliali. Quando vengono differenziate in astrociti, le cellule esprimono il marcatore astrocitario GFAP.Infine, in questa immagine, le cellule sono state differenziate in oligodendrociti ed esprimono il marcatore degli oligodendrociti O4. Una volta acquisita padronanza, la generazione di cellule staminali neurali umane indotte da sangue periferico può essere completata in circa tre settimane.Se eseguita correttamente, la tecnica potrebbe differenziare ulteriormente le cellule staminali neurali in neuroni, eliminando il metodo tradizionale di generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), che è lungo e complesso, e potrebbe rappresentare un'opzione semplice per ottenere colture neuronali specifiche del paziente una volta sviluppata. Questa tecnica apre una nuova strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare modelli di colture cellulari individuali per diverse patologie neurologiche, che potrebbero rappresentare meglio le differenze genetiche associate a disturbi specifici, in particolare a partire da campioni di singoli pazienti.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Qui mostriamo un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs umani da 3-4 ml di sangue periferico utilizzando un singolo vettore lentivirale riprogrammazione. La riprogrammazione delle cellule del sangue prontamente disponibili promette di accelerare l'utilizzo della tecnologia iPSC rendendola accessibile ad una comunità di ricerca più ampio.

Generazione di cellule pluripotenti indotte umane staminali da sangue periferico mediante il STEMCCA lentivirale Vector

Questo video dimostra la riprogrammazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMNC) in cellule staminali neurali indotte (iNSC) utilizzando il virus Sendai. Il virus Sendai è un virus non integrante che offre un veicolo efficiente e sicuro per la riprogrammazione delle cellule.

Generazione di cellule staminali neurali indotte (iNSC) da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMNC): una procedura basata sul virus Sendai per riprogrammare le PBMNC in iNSC

Questo video dimostra la riprogrammazione diretta di cellule progenitrici ematopoietiche geneticamente modificate in cellule staminali neuronali. I fattori di trascrizione espressi dalle cellule progenitrici ematopoietiche innescano una cascata di eventi molecolari che facilitano la loro trasformazione. Ulteriori terreni specifici vengono utilizzati per selezionare e far crescere le cellule staminali neuronali indotte.

Riprogrammazione diretta delle cellule progenitrici ematopoietiche in cellule staminali neurali

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.

Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

Questo protocollo descrive l'efficiente induzione dell'endotelio emogenico e dei progenitori ematopoietici multipotenziali da cellule staminali pluripotenti umane attraverso l'espressione forzata di fattori di trascrizione.

Induzione diretta di Hemogenic endotelio e Sangue da sovraespressione di fattori di trascrizione in cellule staminali pluripotenti umane

Proponiamo un protocollo per la riprogrammazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Placcando le cellule del sangue trasdotte su piastre rivestite di matrice con centrifugazione, le iPSC vengono indotte con successo da cellule galleggianti. Questa tecnica suggerisce un protocollo di riprogrammazione semplice ed efficace per cellule come PBMC e CBMC.

Pluripotenti indotte generazione di cellule staminali da cellule del sangue Utilizzando Sendai Virus e centrifugazione

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la generazione efficiente di iPSC prive di integrazione da cellule del sangue periferico adulto umano. Con l'uso di quattro vettori episomiali basati su oriP/EBNA per esprimere i fattori di riprogrammazione, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 e SOX2, è possibile ottenere migliaia di colonie di iPSC da 1 mL di sangue periferico.

Generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano Utilizzando episomiale Vettori

Il protocollo presenta la riprogrammazione delle cellule mononucleari del sangue periferiche per indurre le cellule staminali neurali mediante l'infezione da virus Sendai, la differenziazione degli iNSC in neuroni dopaminergici, il trapianto di precursori DA nei precursori unilateralmente Modelli murini del morbo di Parkinson e valutazione della sicurezza e dell'efficacia dei precursori DA derivati da iNSC per il trattamento con LA PD.

Generazione di cellule staminali neurali indotte da cellule mononucleari periferiche e differenziazione verso i precursori dei neuroni dopaminergici per gli studi di trapianto

Qui, presentiamo un protocollo per formare con precisione l'endotelio emogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione senza alimentatore e xeno. Questo metodo avrà ampie applicazioni nella modellazione della malattia e nello screening per i composti terapeutici.

Differenziazione dell'endotelio endogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione definita senza alimentatore e Xeno

Qui, presentiamo un protocollo per la caratterizzazione immunofenotipica e la differenziazione citochina indotta del sangue cordonale derivato CD34- cellule staminali ematopoietiche e progenitrici ai quattro lignaggi mieloidi. Le applicazioni di questo protocollo includono indagini sull'effetto delle mutazioni della malattia mieloide o di piccole molecole sulla differenziazione mieloide del CD34- cellule.

Differenziazione pan-mieloide del sangue di cordone umano Derivato CD34- Cellule staminali eseminazioni e progenitrici

Scopri come indurre cellule staminali neurali umane direttamente da cellule progenitrici emopoietiche CD34+ del sangue periferico. Questo metodo innovativo bypassa la generazione di iPSC e offre una fonte accessibile di neuroni per la ricerca sulle malattie neurologiche.

Induzione diretta di cellule staminali neurali umane da cellule periferiche del sangue emopoietiche progenitrici

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