Passaging cellule staminali neuronali

Ciao, sono Steve. Lavoro nel laboratorio del Dr. Flanagan nel Dipartimento di Patologia dell'UC, Irvine. Oggi ti mostrerò come dividere le cellule precursori neurali umane.

Questa tecnica prevede la codifica di un nuovo pallone con una soluzione di fibronectina umana, il sollevamento delle cellule con un tampone di dissociazione cellulare, quindi la neutralizzazione del tampone di dissociazione cellulare con una soluzione di siero al 10%, la centrifusione della sospensione cellulare e la sospensione del resus delle cellule in fresco, terreno e trasferimento della sospensione cellulare in un nuovo pallone. Nel nostro laboratorio, coltiviamo cellule precursori neurali umane cambiando metà dei loro terreni a giorni alterni e le facciamo passare circa una volta alla settimana dividendole una a due. Quando passo le cellule, posso contarle se voglio scambiarle con un esperimento di immunochimica, o se voglio fare una trasfezione con un effettore nucleare.

È importante utilizzare un tampone di dissociazione cellulare quando si impacchettano le cellule perché in primo luogo non è enzimatico, a differenza della tripsina, ed è molto più delicato sulle cellule. Ciao, siamo nella sala di coltura dei tessuti Ora, e prima di mostrarvi come appare un pallone confluente di cellule precursori umane, per prima cosa preparerò la coltura dei tessuti. Per prima cosa, spengo la luce UV e accendo la luce e il flusso d'aria.

Successivamente, disinfetterò il cofano con etanolo al 70% spruzzando un tovagliolo di carta e strofinando il cofano. È importante spruzzare un tovagliolo di carta con etanolo al 70% e non direttamente all'interno della cappa perché spruzzare la cappa con etanolo al 70% potrebbe danneggiare il filtro HEPA, che è davvero costoso. Successivamente, spruzzerò tutti i reagenti e gli strumenti.

E infine, spruzzo i tubi dell'aspirapolvere e siamo a posto. Diamo un'occhiata a queste cellule. Quindi queste cellule sembrano circa l'80% confluenti.

Si tratta di cellule precursori neurali umane isolate da feti umani e le coltiviamo in fiasche T 25. Li dividiamo circa ogni settimana, uno o due. Ora sono pronto a far passare le mie cellule.

E per prima cosa porterò una nuova fiaschetta T 25 che ho rivestito per quattro ore con fibronectina umana di BD biosciences. Così ho rimosso la soluzione di fibronectina. Sciacquerò questo pallone con BBS prima di spostare le celle nel pallone.

E ora tirerò fuori le cellule dall'incubatrice a 37 gradi. Eccoli. Ora rimuoverò la soluzione di lavaggio PBS dal nuovo pallone che è stato rivestito con fibronectina umana.

E aggiungerò due millilitri di vecchio terreno condizionato nel nuovo pallone. Quindi ora ho bisogno di sciacquare le mie cellule con il PBS prima di poterlo rimuovere dalla superficie. Quindi, per prima cosa, rimuoverò il terreno rimanente, aggiungerò subito circa due mil di PBS senza bagnare le celle che si asciugano.

Aspetterò circa due minuti prima di rimuovere il PBS e mettere in vendita il buffer di dissociazione per togliere le vendite dalla superficie della contraerea. Ora rimuoverò la PBS e, di nuovo, cercherò di aggiungere subito un tampone di dissociazione cellulare in modo che le cellule non si secchino. Quindi aggiungerò 1,5 mil di tampone di dissociazione cellulare.

E a differenza del PBS, lo aggiungerò direttamente sulle celle e cercherò di coprire quanta più superficie possibile. Quindi sto spostando il pallone da un lato all'altro mentre aggiungo lentamente questo tampone sulle cellule. E ora aspetterò circa cinque minuti prima che le celle inizino a staccarsi dalla superficie.

E lascerò la borraccia a temperatura ambiente nel cappuccio. Come potete vedere qui, le cellule iniziano prima ad arrotondarsi per eccesso e poi iniziano a staccarsi dalla superficie e si possono effettivamente vedere alcune, alcune cellule che già galleggiano. E se tocchi ampiamente la fiaschetta sul lato, questo li aiuterà a staccarsi.

Sono passati cinque minuti e, come potete vedere, la soluzione è diventata molto densa di cellule che si sono staccate dalla superficie. E ora neutralizzerò l'effetto del tampone di dissociazione cellulare aggiungendo 4,5 mil di siero contenente terreno. Quindi userò il siero fetale bovino inattivato al 10% di calore in terreni D-M-E-M-F 12, e lo aggiungerò direttamente sulla superficie del pallone per assicurarmi che non rimangano cellule attaccate.

E lo farò, e pipetterò delicatamente su e giù per rimuovere qualsiasi, tutte le cellule rimanenti. E poi trasferirò la soluzione cellulare in una provetta conica da 15 mil. E lo farò girare a mille giri al minuto per un minuto.

Quindi le celle hanno finito di girare e abbiamo qui una bellissima tavolozza di celle. Rimuoverò il siero con molta attenzione senza cercare di disturbare il pallet. E poi rimetterò in sospensione il pallet in quattro milioni di media.

Quindi cercherò di risospendere il pellet in modo che ci siano, siano, non rimangano grumi di cellule in modo che la soluzione diventi omogenea e contenga, non contenga grumi. E dato che sto facendo una divisione uno a due, prenderò due dei quattro mulini e li trasferirò nel nuovo pallone che contiene già due mil del terreno di prova. E infine, etichetterò il pallone con il tipo di cella, il numero di passaggio e la data.

Questo è uno sguardo alle celle che abbiamo attraversato mezz'ora fa. E come potete vedere, la maggior parte di loro si è attaccata alla superficie e ha iniziato a inviare processi. Questo è tutto gente.

E ora sono pronto a contare.