Name: Passaging cellule staminali neuronali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Impara il passaggio di cellule staminali neuronali umane (hNSPCs) in vitro usando fibronectina umana e buffer di dissociazione. Questo metodo migliora la riproducibilità nella ricerca sulle cellule staminali.

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Gli autori ringraziano il Dott. Philip H. Schwartz del National Human Resource neurale delle cellule staminali presso l&#39;Ospedale dei Bambini, Orange County Istituto di Ricerca per la fornitura di hNSPCs e l&#39;istruzione iniziale nella loro coltura.

Nota: Per la coltura di routine dei nostri hNSPCs, cambiamo 50-100% dei media a giorni alterni e di solito li passaggio 01:02 una volta alla settimana. La cultura dei media contiene il 20% BIT-9500, 1X fattori antibiotica / antimicotica, e la crescita (EGF, FGF, PDGF e ciascuno a 40 ng / ml) in DMEM: F12 i media di base. Preparazione del Flask patinate e Dissociare le celle <ol><li> Per preparare nuovi palloni per le cellule diversi passaggi, cappotto fiasche T25 con 10 mg / ml fibronectina umana in Emem per 4 ore, o durante la notte, a 37 ° C di coltura tissutale incubatore. Poco prima passaging le cellule, rimuovere la soluzione fibronectina e risciacquare i palloni con PBS. </li><li> Trasferire il vecchio &quot;condizionato&quot; media dalle cellule da diversi passaggi per il nuovo fibronectina rivestite palloni (in modo tale che la metà del volume finale di media per ogni pallone sarà la &quot;condizione&quot; media). Queste condizioni di coltura contribuiscono a mantenere queste cellule nel loro stato indifferenziato. </li><li> Una volta che tutti i media viene rimosso dalle cellule di diversi passaggi, lavare le cellule una volta con PBS. Fare attenzione a secco non fuori le cellule. </li><li> Aggiungi cellulare dissociazione Buffer (CDB) direttamente sulle celle (1,0-1,5 ml per un pallone T25). Incubare le cellule nel buffer per circa 5 minuti a temperatura ambiente. Picchiettando delicatamente il pallone contribuirà ad accelerare il distacco delle cellule. </li></ol> Centrifugazione, risospensione, e celle placcatura <ol><li> Aggiungi siero contenenti media (DMEM: F12 con il 10% di siero siero fetale bovino) (usare ~ 3 volte il volume di CDB) al pallone con le cellule distaccata. Rimuovere il supporto e le cellule in una provetta da 15 ml. Utilizzare un piccolo volume di fresca siero contenente i media per sciacquare il pallone e recuperare le cellule residue. </li><li> Centrifugare i media e le celle a 1000 giri (~ 200xg) per 5 minuti. </li><li> Aspirazione fuori il siero contenenti media e risospendere le cellule in terreni di coltura fresco, pipettando su e giù per ottenere una sospensione omogenea cellulare. </li><li> Trasferire la metà delle cellule risospese in ogni pallone nuovo per una frazione di 1:2. Si noti il ​​nuovo numero passaggio sul pallone. </li></ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell culture.</a> Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture.+Progenitor+cells+from+human+brain+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture. Progenitor cells from human brain after death.</a> Nature. 411, 42-43 (2001).</li>
<li>Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+neural+progenitor+cells+from+post-mortem+human+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex.</a> J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).</li>
</ol>

Abbiamo scoperto che questo protocollo offre culture affidabile hNSPCs. Un fattore critico per le nostre cellule è che hanno bisogno di essere mantenuto il più culture piuttosto denso e non possono essere diversi passaggi al punto che le cellule sono scarse. Nelle nostre mani, le culture sparse crescono molto lentamente o cessare completamente divisione. Per questo motivo, siamo soliti suddividere le nostre culture 1:2 o 1:3 quando una cultura è estremamente denso. Rivestimento della superficie di un piatto cultura con fibronectina è import...

<table><tbody><tr><td>BIT-9500 (BSA, Insulina, Transferrina)</td><td>Reagente</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>09500</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12 (1X)</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>Reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>Distribuito da Fisher con il numero di catalogo indicato</td></tr><tr><td>Siero Fetale Bovino</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>FGF, ricombinante umano di base</td><td>Reagente</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AB</td><td>Reagente</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>EGF, ricombinante umano</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40052</td><td>Distribuito da Fisher con il numero di catalogo indicato</td></tr><tr><td>Flacone per coltura cellulare, 25 cm²</td><td>Strumento</td><td>Corning</td><td>10-126-28</td><td>Distribuito da Fisher con il numero di catalogo indicato</td></tr><tr><td>Fibronectina, umana, naturale</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40008A</td><td>Distribuito da Fisher con il numero di catalogo indicato</td></tr><tr><td>Cellule Staminali/Precursori Neurali Umane</td><td>Cellule</td><td>Risorsa Nazionale per Cellule Staminali Neurali Umane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer di Dissociazione Cellulare</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>13150-016</td><td></td></tr></tbody></table>

passaging cellule staminali neuronali

Passaging Human Neural Stem Cells

La capacità di manipolare le staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs) in vitro fornisce un mezzo per indagare la loro utilità come i trapianti di cellule per scopi terapeutici e di esplorare molti processi fondamentali dello sviluppo umano neurale e patologia. Questo protocollo presenta un semplice metodo di coltura e hNSPCs passaging nella speranza di standardizzazione questa tecnica e aumentando la riproducibilità della ricerca sulle cellule staminali. Il hNSPCs che usiamo sono stati isolati da cadavere corteccia cerebrale postnatale dal National Human Resource cellule staminali neurali e cresciuto come culture aderente su fiaschi rivestiti con fibronectina (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Noi la nostra cultura hNSPCs in DMEM: F12 senza siero dei media integrato con EGF, FGF, PDGF e di passaggio e le 01:02 circa ogni sette giorni. Utilizzando queste condizioni, la maggior parte delle cellule in cultura mantenere una morfologia bipolare ed esprimono marker di cellule indifferenziate staminali neurali (come nestina e Sox2).

La capacità di manipolare le staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs) in vitro permette di indagare la loro utilità come i trapianti di cellule a fini terapeutici e di esplorare lo sviluppo umano neurale. Questo protocollo presenta un metodo di coltura e hNSPCs passaging nella speranza di aumentare la riproducibilità della ricerca sulle cellule staminali.

Passaging cellule staminali neuronali

La capacità di manipolare in vitro le cellule staminali/precursori neurali umani (hNSPCs) offre un modo per indagarne l'utilità come trapianti cellulari per...

Ciao, sono Steve. Lavoro nel laboratorio del dottor Flanagan presso il Dipartimento di Anatomia Patologica dell'Università della California, Irvine. Oggi vi mostrerò come suddividere le cellule precursori neurali umane.Questa tecnica prevede la codifica di un nuovo flacone con una soluzione di fibronectina umana, il distacco delle cellule mediante buffer di dissociazione cellulare, la successiva neutralizzazione del buffer di dissociazione cellulare con una soluzione al 10% di siero, la centrifugazione della sospensione cellulare e la risospensione delle cellule in mezzo fresco, trasferendo infine la sospensione cellulare in un nuovo flacone. Nel nostro laboratorio coltiviamo cellule precursori neurali umane sostituendo metà del mezzo ogni due giorni e passaggiamo le cellule circa una volta alla settimana con un rapporto di suddivisione da uno a due. Quando passaggio le cellule, potrei contarle se desidero utilizzarle per un esperimento di immunoistochimica o se intendo effettuare una trasfezione con un effettore nucleare.È importante utilizzare un buffer di dissociazione cellulare durante il confezionamento delle cellule perché, innanzitutto, è non enzimatico, a differenza della t

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Biologia

L'introduzione di un gene di interesse in una cellula è un metodo potente per chiarire la sua funzione in vivo. Questo protocollo descrive un metodo efficace di trasfezione di una cultura dei diritti umani neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs) con l'apparecchiatura di Nucleofector elettroporazione fatta da Amaxa.

Trasfezione delle cellule staminali neuronali con il Nucleofector Amaxa

Conoscenza del numero esatto di cellule vitali è necessaria per manipolazioni molte colture di tessuti. Questo protocollo descrive come distinguere tra cellule vive e morte e quantificare le cellule utilizzando un emocitometro. Anche se descrive il conteggio umano neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs), può essere utilizzato per altri tipi di cellule.

Conteggio cellule staminali neuronali

Cellule staminali neurali sono stati preparati da ippocampo di adulti non-letargo yearling scoiattoli artici (AGS). Queste cellule staminali neurali può essere espansa attraverso numerosi passaggi, differenziate e mantenuto come un neurone quasi 50:50 alla cultura gliali.

Crescita e la differenziazione degli adulti ippocampale suolo artico Cellule Staminali neurali Squirrel

Un metodo semplice e affidabile sulle isolamento e la coltura di cellule staminali neurali da scartati tessuto fetale umano corticale è descritto. Culture derivati ​​da noti disturbi neurologici umano può essere utilizzato per la caratterizzazione di processi patologici cellulari e molecolari, oltre a fornire una piattaforma per valutare l'efficacia farmacologica.

Generazione di cellule staminali neurali da scartate tessuto fetale umano corticale

Pazienti con tumore al cervello sottoposti a radioterapia cranica di routine, e per quanto utili, questo trattamento si traduce spesso in debilitanti disfunzione cognitiva. Questo grave problema irrisolto è allo stato attuale, alcun ricorso clinica, e ha spinto i nostri sforzi per ideare terapie con cellule staminali base per il recupero della radiazione indotta decrementa cognitive.

Strategie di trapianto di cellule staminali per il Restauro di disfunzione cognitiva causata da radioterapia craniale

Questo video dimostra il metodo per differenziare le cellule staminali neurali umane dalle neurosfere in progenitori neurali e astrocitari utilizzando il trattamento enzimatico e la coltura in un mezzo ricco di fattori di crescita, che alla fine porta alla maturazione in cellule progenitrici specializzate.

Differenziazione delle cellule staminali neurali umane in progenitori neurali e astrocitari

Cellule staminali neurali raccolte dal cervello adulto sono in aumento utilizzati in applicazioni che vanno dalla ricerca di base dello sviluppo del sistema nervoso ad esplorare potenziali applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Questo rende rigoroso controllo delle condizioni di isolamento e di coltura utilizzate per coltivare queste cellule fondamentali per suonare i risultati sperimentali.

Crescere cellule staminali neurali da Regioni convenzionali e non convenzionali del cervello adulto Roditore

Questo protocollo descrive un metodo tagliere meccanico romanzo che consente l'espansione di staminali e cellule progenitrici aggregati sferici neurali senza dissociazione di una sospensione di cellule singole. Mantenere il contatto cellula / cellula consente una crescita rapida e stabile per oltre 40 passaggi.

Un metodo di espansione cGMP-applicabile per Aggregati di neurali umane staminali e cellule progenitrici derivate da cellule staminali pluripotenti o fetale tessuto cerebrale

Un metodo è stato sviluppato per derivare direttamente le cellule staminali neurali umane da cellule progenitrici ematopoietiche arricchite da cellule del sangue periferico.

Induzione diretta di cellule staminali neurali umane da cellule periferiche del sangue emopoietiche progenitrici

Con l'intento di caratterizzare i cambiamenti nei miRNA su cellule staminali neurali umane differenziate (hNSC), descriviamo la differenziazione delle hNSC su un sistema tridimensionale, la valutazione dei cambiamenti nell'espressione dei microRNA mediante array PCR di miRNA e l'analisi computazionale per la previsione del bersaglio dei miRNA e la sua convalida mediante doppio saggio della luciferasi.

Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

Il midollo spinale adulto dei mammiferi contiene cellule staminali/progenitrici neurali (NSPC) che possono essere isolate ed espanse in coltura. Questo protocollo descrive la raccolta, l'isolamento, la coltura e il passaggio di NSPC generate dalla regione periventricolare del midollo spinale adulto dal ratto e da donatori di trapianto di organi umani.

Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano

Impara il passaggio di cellule staminali neuronali umane (hNSPCs) in vitro usando fibronectina umana e buffer di dissociazione. Questo metodo migliora la riproducibilità nella ricerca sulle cellule staminali.

Passaging cellule staminali neuronali

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