Name: Transmembrana Oligomerizzazione Propensione dominio determinato dal saggio ToxR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Scopri come valutare la propensione all'oligomerizzazione dei domini transmembrana utilizzando il saggio ToxR in E. coli. Questo metodo permette di quantificare l'interazione proteica in un ambiente lipidico naturale.

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Ringraziamo il National Institutes of Health (1R21CA138373 e Stand Up to Cancer (SU2C) per supporti finanziari di questo lavoro. HY è grato per la Award 2009 Elion dalla American Association of Cancer Research, un Kimmel Scholar Award dalla Fondazione per la Sidney Kimmel Ricerca sul Cancro (SKF-08-101), e la National Science Foundation Facoltà primi Premio alla Carriera (NSF0954819).

1. Considerazioni sulla clonazione <ol><li> Oligonucleotidi commercialmente preparato che rappresenta il TMD di interesse affiancato da NheI e siti di restrizione BamHI e 5'-fosforilato può essere legata in pTox7 (modificato nel nostro laboratorio mediante inserimento di una coppia di basi direttamente dopo il sito di restrizione BamHI 14) (Figura 3) digerito in sequenza con BamHI e NheI. Un oligonucleotide esempio è mostrato sotto: 5'ctagcTMDSEQUENCEg3 ' 3 'gTMDSEQUENCEcctag5' </li></ol> La sequenza TMD dovrebbe essere 12-24 residui (brevi sequenze presumibilmente sarà allungata da residui idrofobici vettore di codifica). Al fine di indagare l'interfaccia, quattro varianti del design TMD dovrebbero essere creati dove inserimenti residui sequenziale e concomitante risultato residui delezioni nel rotazione del relativo TMD a ToxR. 15,16, infine, la concentrazione arabinosio dovrebbe essere variato tra 0,001 e 0,01% (w / v) per identificare la concentrazione di cui si rilevino differenze massima β-galattosidasi segnali tra le diverse sequenze TMD, alla verifica dei livelli di espressione differenti si raccomanda di identificare condizioni di affinità diverse si possono distinguere meglio. Oltre a arabinosio e antibiotici, 0,4 mM IPTG possono essere utilizzate per migliorare le differenze di affinità tra TMD diverse. La misura ToxR dovrebbe essere eseguito almeno in quattro esemplari. Tutta la procedura dovrebbe essere ripetuta almeno tre volte con diverse trasformazioni plasmide. 2. La crescita di colture batteriche <ol><li> Delicatamente disgelo FHK12 cellule competenti (200 microlitri) su ghiaccio e trasferire in una provetta da 15 ml cultura. Aggiungi DNA plasmidico (200 ng) e incubare le cellule in ghiaccio per 30 min. </li><li> Heat-shock cellule mediante incubazione per 90 s a 42 ° C, seguita da incubazione in ghiaccio per 2 minuti. </li><li> Aggiungi SOC mezzi di comunicazione (800 microlitri) e incubare i campioni a 37 ° C con agitazione (300 giri) per un h. </li><li> Inoculare 5 media LB ml con cloramfenicolo (30 mg / ml) e arabinosio (0,0025% w / v) con 50 microlitri della miscela trasformazione in provette da 15 ml cultura in triplice copia. Incubare i campioni a 37 ° C con agitazione (300 rpm) per 20 h. (In alternativa 5 ml di cultura può essere utilizzato per inoculare 100 l di media in una piastra da 96 pozzetti. Questo metodo è utile quando si tratta di un gran numero di campioni, anche se gli errori saranno leggermente più alto. Al fine di evitare l'evaporazione, il che porterebbe per errore, riempire i pozzi più esterna con i media, ma non li usano per i campioni. Infine, doppio avvolgere la giunzione tra il coperchio e il piatto con parafilm). </li></ol> 3. Misura della β-galattosidasi <ol><li> Preriscaldare il piatto-reader a 28 ° C. </li><li> Trasferire la Z-buffer in un serbatoio con un puntale di grandi dimensioni, facendo attenzione a prendere solo la parte superiore (acquoso) strato. Trasferire 100 ml di Z-buffer/chloroform preparati al momento ai pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Trasferire 5 ml di ciascuna cultura nei pozzetti della piastra in quattro esemplari. Omettere la cultura da quattro pozzi che servirà come il vuoto. </li><li> Misurare il diametro esterno 595 del piatto per determinare la densità delle cellule. </li><li> Aggiungere 50 ml di Z-buffer/SDS a tutti i pozzetti della piastra. Agitare la piastra sulla piastra-reader per 10 minuti a Lyze le cellule. Assicurarsi che le sospensioni cellulari sono chiare dopo la lisi e ripetere il passo tremante, se necessario. Lisi incompleta suggerisce il Z-buffer/chloroform non era preparato fresco. </li><li> Aggiungere 50 microlitri preparati al momento Z-buffer/ONPG a tutti i pozzetti e tornare la piastra per il lettore di piastre e misurare OD 405 ogni 30 s per 20 min. </li><li> Calcolare β-galattosidasi utilizzando la seguente equazione (ricordandosi di sottrarre il vuoto). Il rapporto di OD 405 / min deve essere calcolata utilizzando tutti i punti dati nel campo 405 OD 0,0-1,0 usando un adattamento lineare modello. <img src="files/ftp_upload/2721/2721eq1.jpg" alt="Equazione 1"> Unità Miller differiscono a volte quando registrate in giorni diversi. Quindi, un costrutto di riferimento come AAP dovrebbe essere misurata in ciascuna prova. I suoi valori possono essere utilizzati per la normalizzazione dei valori ToxR. </li></ol> 4. Controllo per l'espressione della proteina <ol><li> Eseguire Western blotting per verificare anche l'espressione della proteina tra i costrutti. Unire 50 ml di culture triplice copia e centrifuga (2000 rpm, 4 min) in una microcentrifuga. Rimuovere il surnatante pipettando e risospendere il pellet residuo in 2 tampone di caricamento del campione x. </li><li> Carico di 7,5 microlitri su un gel standard 8% ed effettuare elettroforesi a 125 V per 1 ora 5 min. Dopo il trasferimento, incubare con anticorpi anti-MBP HRP-anticorpo coniugato e visualizzare, la proteina chimerica è osservata a circa 70 kDa con alcuni prodotti di degradazione a volte visto circa 48 kDa. MBP endogena è osservato anche a 45 kDa (Figura 5). </li></ol>5. Controllo per l'inserimento corretto di membrana Una linea di cellule carenti di proteina legante il maltosio viene utilizzato per valutare il corretto inserimento della membrana del costrutto chimerico TMD. Quando coltivate su terreno minimo con il maltosio come unica fonte di carbonio, solo le cellule che esprimono una membrana integrale prodotto espressione di proteine ​​maltosio legame correttamente situato a periplasma sono in grado di crescere. <ol><li> PD28 trasformare cellule (come descritto per FHK12 cellule) e inoculare 2 ml di LB medium. Crescere le cellule a 37 ° C con agitazione (300 rpm) durante la notte. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione a 3500 rpm, 10 min, 4 ° C e lavare da risospensione in PBS (2 ml) pipettando dolce con una punta di grandi dimensioni o vortexando gentilmente. Agglomerare le cellule (come sopra), lavare con PBS per la seconda volta, pellet e risospendere infine, in PBS (1 ml). </li><li> Usare 25 ml di cellule risospese per inoculare 5 Mezzi ml minimo in triplice copia e incubare a 37 ° C con agitazione (300 giri). Prendere OD 595 letture tra 15-25 h, circa ogni 2 ore con il trasferimento di 200 ul di ciascun campione in una piastra da 96 pozzetti e la lettura con la piastra-reader. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Un esempio di utilizzo del test ToxR giornalista trascrizionale di analizzare la propensione oligomerizzazione di domini transmembrana in Figura 4. In precedenza abbiamo studiato la oligomerizzazione di domini transmembrana dal multispanning membrana integrante latente della membrana proteica proteine-1 (LMP-1) con varie tecniche, tra cui ToxR 14 domini transmembrana cinque (TM5) è stato dimostrato che mostra una forte propensione a oligomerize.; ciò è dimostrato da alte Unità Miller, paragonabile al controllo positivo, GPA, una solida sequenza dimerizing. Una mutazione deleteria in TM5, D150A, riduce la capacità della sequenza di oligomerize. LMP-1 TM1 non influisce significativamente oligomerize e presenta un bassissimo segnale Unità Miller, appena sopra il segnale per il valore vuoto, non trasformato FHK12 cellule. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Cartoon Figura 1. Raffigurante il saggio giornalista ToxR. Dominio transmembrana (TMD) guidato risultati oligomerizzazione in dimerizzazione di ToxR e l'attivazione della trascrizione LacZ. Il prodotto del gene di LacZ, β-galattosidasi può essere quantificato in una misura della propensione di un TMD a oligomerize. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. La scissione idrolitica di ONPG da β-galattosidasi risultati nella produzione di specie che assorbono la luce, o-nitrofenolato (ONP). <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Plasmidi mappa di pToxR7. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Rappresentante saggio giornalista ToxR trascrizionale analizzare la propensione oligomerizzazione di membrana latente proteina-1 domini transmembrana. Dominio transmembrana 5 (TM5) oligomerizes fortemente, mentre il dominio transmembrana 1 (TM1) presenta solo una interazione debole. D150A mutazione in TM5 riduce in modo significativo la sua capacità di oligomerize. GPA è incluso come una sequenza di controllo positivo per dimerizzazione forte. Vuoto rappresenta FHK12 cellule non trasformate. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Western Blot per l'espressione delle proteine. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. PD28 saggio di complementazione di controllo per l'inserimento della membrana corrette al periplasma. Controllo negativo rappresenta un costrutto carente di maltosio legame proteico.

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<li>Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hetero-assembly+between+all-L-+and+all-D-amino+acid+transmembrane+domains%3A+forces+involved+and+implication+for+inactivation+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins.</a> J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).</li>
<li>Sammond, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+peptides+used+to+investigate+the+homo-oligomeric+interface+and+binding+hot-spot+of+the+oncogene%2C+latent+membrane+protein+1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1.</a> , Forthcoming (2010).</li>
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<li>Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interface+between+self-assembling+erythropoietin+receptor+transmembrane+segments+corresponds+to+a+membrane-spanning+leucine+zipper%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper.</a> J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).</li>
<li>Finger, C., Escher, C., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single+transmembrane+domains+of+human+receptor+tyrosine+kinases+encode+self-interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions.</a> Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La trascrizione saggio giornalista ToxR è un modo facile per identificare sequenze transmembrana con la possibilità di oligomerize. Dato che le interazioni avvengono all&#39;interno della membrana batterica interna, questo saggio aggira i problemi associati con la validità dei sistemi di studiare in ambienti di membrana-mimetici. Dato che la clonazione di TMD multipli in un singolo plasmide può facilmente essere fatto in parallelo e il test completo può essere effettuata in 96-ben formato piatto, questo test può essere ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Enzima di restrizione BamHI </td><td> Invitrogen </td><td> 15201023 </td><td> Invitrogen enzimi sono stati trovati per essere più efficiente di altri fornitori </td></tr><tr><td> NheI enzima di restrizione </td><td> Invitrogen </td><td> 15444011 </td><td> Invitrogen enzimi sono stati trovati per essere più efficiente di altri fornitori </td></tr><tr><td> Provette da 15 ml cultura </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-956-1J </td><td></td></tr><tr><td> SOC mezzi di comunicazione </td><td> Teknova </td><td> S0225 </td><td> Composto al volume appropriato e sterilizzati in autoclave. </td></tr><tr><td> LB mezzi di comunicazione </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L7275 </td><td> Composto al volume appropriato e sterilizzati in autoclave. </td></tr><tr><td> Cloramfenicolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CO 3 78 </td><td> Soluzione madre di 30 mg / ml in etanolo conservati in congelatore </td></tr><tr><td> Arabinosio </td><td> Fluka </td><td> 10839 </td><td> Soluzione madre di 2,5% (w / v) in acqua immagazzinata nel congelatore </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9390 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Mallinckrodt chimici </td><td> 6858-06 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 0,7 H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 63138 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecylsulfate sodio (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Nitrophenyl β-D-galattopiranoside (ONPG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 73660 </td><td></td></tr><tr><td> Z-buffer </td><td></td><td></td><td> 16,1 g di Na 2 HPO 4 5.5g NaH 2 PO 4 0,75 g di KCl 0.246g MgSO 4 Portare a 1 l, pH 7,0 </td></tr><tr><td> Z-buffer/chloroform </td><td></td><td></td><td> 200 mL β-mercaptoetanolo, 2 ml di cloroformio, portare a 20 ml con Z-buffer. Vortex per 1 min, centrifugare per 1 min a 800 giri al minuto. Fai fresco per ogni piatto. </td></tr><tr><td> Z-buffer/SDS </td><td></td><td></td><td> 160 mg SDS sciolto in 10 mL di Z-buffer </td></tr><tr><td> Z-buffer/ONPG </td><td></td><td></td><td> ONPG 40 mg in 10 ml di Z-buffer. Fai fresco per ogni piatto </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-MBP anticorpi monoclonali (HRP coniugata) </td><td> NEB </td><td> E8038S </td><td></td></tr><tr><td> Terreno minimo con maltosio </td><td></td><td></td><td> 1 x M9 sali, 0,4% maltosio, 1 mg / mL tiamina, 2 mM MgSO 4 </td></tr><tr><td> 96 pozzetti fondo piatto </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1835.300 </td><td></td></tr><tr><td> Piastra-reader </td><td> Beckman Coulter </td><td> DTX880 Detector Multimode </td><td></td></tr><tr><td> Bagnomaria </td><td> VWRI </td><td> 89032-204 </td><td></td></tr><tr><td> Scuotendo incubatore </td><td> FormaScientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transmembrana oligomerizzazione propensione dominio determinato dal saggio toxr

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

La visione semplicistica di domini di proteine ​​transmembrana semplicemente come ancore in doppi strati di fosfolipidi è stata da tempo confutata. In molti casi, attraversa la membrana le proteine ​​si sono evoluti meccanismi altamente sofisticate di azione. 1-3 Un modo in cui le proteine ​​di membrana in grado di modulare le loro strutture e delle funzioni avviene attraverso il contatto diretto e specifico di eliche idrofobiche, formando oligomeri transmembrana strutturato. 4,5 recente molto lavoro si è concentrato sulla distribuzione degli aminoacidi preferenzialmente trovato nell&#39;ambiente della membrana rispetto alla soluzione acquosa e le forze intermolecolari diverse proteine ​​associazione unità. 6,7 Tuttavia, gli studi di riconoscimento molecolare al dominio transmembrana di proteine ​​ancora in ritardo rispetto quelli di solubili in acqua le regioni. Un grande ostacolo rimane: nonostante la notevole specificità e affinità che oligomerizzazione transmembrana può raggiungere, 8 misura diretta della loro associazione è impegnativo. Metodologie tradizionali applicati allo studio della funzione integrale proteina di membrana può essere ostacolato dalla insolubilità intrinseca delle sequenze in esame. Conoscenze acquisite studiando biofisici peptidi sintetici che rappresentano domini transmembrana in grado di fornire utili visione strutturale. Tuttavia, la rilevanza biologica del micellare detergente o sistemi di liposomi utilizzati in questi studi per imitare le membrane cellulari è spesso messa in discussione; fare peptidi adottare un nativo struttura simile in queste condizioni e che il loro comportamento funzionale rispecchiano le reali modalità di azione all&#39;interno di una membrana nativa ? Al fine di studiare le interazioni delle sequenze transmembrana in doppi strati di fosfolipidi naturali, il laboratorio Langosch sviluppato test giornalista trascrizionale ToxR. 9 Il dominio transmembrana di interesse è espresso come una proteina chimerica con maltosio legame con le proteine ​​per la posizione al periplasma e ToxR a fornire una relazione del livello di oligomerizzazione (Figura 1). Negli ultimi dieci anni, diversi altri gruppi (ad esempio Engelman, DeGrado, Shai), ulteriormente ottimizzato e applicato questo saggio giornalista ToxR. 10-13 I saggi ToxR vari sono diventati un gold standard per testare interazioni proteina-proteina nelle membrane cellulari. Siamo qui dimostrare una tipica operazione sperimentale condotto nel nostro laboratorio che segue principalmente i protocolli sviluppati da Langosch. Questo metodo generalmente applicabile è utile per l&#39;analisi di dominio transmembrana auto-associazione in E. coli, in cui viene utilizzato β-galattosidasi produzione per valutare la propensione TMD oligomerizzazione. Su TMD indotta dimerizzazione, ToxR si lega al promotore ctx causando up-regolazione del gene LacZ per β-galattosidasi. Una lettura colorimetrica ottenuto mediante aggiunta di ONPG alle cellule lyzed. Scissione idrolitica di ONPG da β-galattosidasi risultati nella produzione di specie che assorbono la luce, o-nitrofenolato (ONP) (Figura 2).

Una procedura efficace per valutare la propensione oligomerizzazione del single-pass domini transmembrana (TMD) è descritta. Proteine ​​chimeriche costituito dalla TMD fusa ToxR sono espressi in un ceppo di E. coli giornalista. TMD indotta oligomerizzazione cause dimerizzazione di ToxR, l&#39;attivazione della trascrizione e la produzione della proteina reporter-galattosidasi.

Transmembrana Oligomerizzazione Propensione dominio determinato dal saggio ToxR

La visione eccessivamente semplificata dei domini transmembrana delle proteine come meri ancoraggi nei doppi strati fosfolipidici è stata smentita da tempo. In molti casi...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare le propensioni alla ligamentizzazione di proteine, domini transmembrana o domini TM in un ambiente membranario naturale. Questo viene ottenuto esprimendo il dominio transmembrana di interesse in *E. coli* come proteina chimerica con la proteina legante il maltosio per il targeting al periplasma e ToxR come reporter trascrizionale; la ligamentizzazione indotta dal dominio transmembrana provoca il dimerizzazione di ToxR e l'attivazione della trascrizione di LXi. In un secondo passaggio, le cellule vengono lisate e trattate con ONPG, che viene idrolizzato dalla beta-galatto alla specie assorbente alla luce, o-nitrofenolato o ONP.I livelli successivi di ONP vengono quantificati misurando l'assorbanza della luce a 405 nanometri. Per determinare i livelli di dominio transmembrana, i risultati della legamentizzazione rivelano la propensione alla legamentizzazione dei domini transmembrana in base a un saggio con reporter tox R. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi biofisici esistenti, come la SDS-PAGE o la fluorescenza, è che il comportamento del dominio transmembrana viene studiato in un doppio strato fosfoli

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Approcci genetici e biochimici per<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; La valutazione di proteine ​​Oligomerizzazione: Il rianodina Receptor Case Study

Molte proteine svolgono la loro funzione quando sono attaccate alle superfici della membrana. Il legame di proteine estrinseche sulle membrane dei nanodischi può essere indirettamente ripreso mediante microscopia elettronica a trasmissione. Mostriamo che il caratteristico impilamento (rouleau) dei nanodischi indotto dal fosfotungstato di sodio con colorazione negativa è impedito dal legame della proteina estrinseca.

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Questo protocollo è stato sviluppato per studiare la transizione dimero-dodecamero di TmPep1050, un'amminopeptidasi M42, a livello strutturale. È una pipeline semplice che parte dalla purificazione delle proteine all'elaborazione dei dati a raggi X. La cristallogenesi, l'indicizzazione del set di dati e la sostituzione molecolare sono state enfatizzate attraverso un caso di studio, variante TmPep1050H60A H307A.

Cristallografia a raggi X per studiare la transizione di stato oligomerica della termotoga maritima M42 Aminopeptidasi TmPep1050

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la ricostituzione dell'attività di estrazione di Msp1 con componenti completamente purificati in proteolipolisi definiti.

Ricostituzione dell'attività estrattiva msp1 con componenti completamente purificati

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare l'ultima versione dello strumento SeqAPASS (Sequence Alignment to Predict Across Species Suceptibility) dell'Agenzia per la protezione ambientale degli Stati Uniti. Questo protocollo dimostra l'applicazione dello strumento online per analizzare rapidamente la conservazione delle proteine e fornire previsioni personalizzabili e facilmente interpretabili della suscettibilità chimica tra le specie.

Dimostrazione dell'allineamento delle sequenze per prevedere lo strumento di suscettibilità tra le specie per una rapida valutazione della conservazione delle proteine

Presentato qui è un protocollo che utilizza Leishmania major promastigotes per determinare il legame, la citotossicità e la segnalazione indotta dalle tossine che formano i pori. Viene fornita una prova di concetto con streptolisina O. Altre tossine possono anche essere utilizzate per sfruttare i mutanti genetici disponibili in L. major per definire nuovi meccanismi di resistenza alle tossine.

Decifrare il meccanismo molecolare e la funzione delle tossine che formano i pori usando la Leishmania major

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia TIRF per tracciare i singoli canali ionici e determinare la loro attività nelle membrane lipidiche supportate, definendo così l'interazione tra il movimento laterale della membrana e la funzione del canale. Descrive come preparare le membrane, registrare i dati e analizzare i risultati.

Imaging a singola molecola della mobilità laterale e dell'attività dei canali ionici in doppi strati lipidici mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Qui descriviamo i protocolli per la caratterizzazione biofisica della formazione di complessi ternari indotti da chimere mirate alla proteolisi (PROTACS) che coinvolgono le ubiquitina ligasi Von Hippel-Lindau E3 ligasi (VHL) e Cereblon (CRBN).  I metodi biofisici qui illustrati includono la risonanza plasmonica di superficie (SPR), l'interferometria del biostrato (BLI) e la calorimetria di titolazione isotermica (ITC).

Lo sviluppo e l'applicazione di saggi biofisici per la valutazione della formazione di complessi ternari indotti da chimere mirate alla proteolisi (PROTACS)

Le funzioni delle proteine della superfamiglia delle dinamine dipendono dai cambiamenti conformazionali associati all'idrolisi del GTP. Viene descritto un sistema utilizzando la tecnica FRET a molecola singola (smFRET) per monitorare la dinamica conformazionale dell'atlastina GTPasi simile alla dinamina in diversi stati di carico nucleotidico.

Imaging FRET a singola molecola per l'osservazione delle dinamiche conformazionali della GTPasi dinamina atlastina

Scopri come valutare la propensione all'oligomerizzazione dei domini transmembrana utilizzando il saggio ToxR in E. coli. Questo metodo permette di quantificare l'interazione proteica in un ambiente lipidico naturale.

Transmembrana Oligomerizzazione Propensione dominio determinato dal saggio ToxR

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