Transmembrana Oligomerizzazione Propensione dominio determinato dal saggio ToxR

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di studiare le propensioni alla legamentosità di proteine, domini transmembrana o T MD in un ambiente di membrana naturale. Ciò si ottiene esprimendo il dominio transmembrana di interesse in e coli come proteina chimerica con proteina legante il maltosio per la localizzazione nel periplasma e nella tossina. R come reporter trascrizionale, la legamentizzazione indotta dal dominio transmembrana provoca la dimerizzazione della tossina R e l'attivazione della trascrizione LXi Come seconda fase, le cellule vengono lisate e trattate con ONPG, che viene idrolizzato dal beta galacto alla specie che assorbe la luce O nitro folato o ONP.

Successivamente, i livelli di ONP vengono quantificati misurando l'assorbanza della luce a 405 nanometri. Al fine di determinare i livelli del dominio transmembrana, i risultati della legamentosità rivelano la propensione alla legamentosità dei domini transmembrana sulla base di un saggio reporter tox R. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi biofisici esistenti come la pagina SDS o la fluorescenza, è che il comportamento del dominio transmembrana è studiato in un doppio strato fosfolipidico naturale per espressione in e coli piuttosto che in un sistema mimetico di membrana come un detergente da solo.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle proteine di membrana, come la delucidazione delle caratteristiche strutturali chiave coinvolte nell'associazione dell'elica transmembrana Prima dell'inizio di questo protocollo, sette plasmidi che esprimono la proteina chimerica richiesta sono stati preparati da oligonucleotidi sintetizzati commercialmente, che rappresentano il TDS di interesse affiancato da NHE e BMH. I siti di restrizione dopo che i plasmidi sono stati preparati scongelano delicatamente le cellule competenti fhk 12 sul ghiaccio. Una volta scongelate, trasferite le cellule in provette di coltura da 15 millilitri a 200 nanogrammi di ciascun DNA plasmatico in una provetta separata e incubate le cellule su ghiaccio per 30 minuti.

Quindi shock termico delle cellule per 90 secondi a 42 gradi Celsius, seguito da incubazione su ghiaccio per due minuti a 800 microlitri di terreno SOC e incubazione dei campioni a 37 gradi Celsius con agitazione per un'ora dopo l'incubazione, inoculato cinque millilitri di terreno LB contenente cloramfenicolo e aose con 50 microlitri della miscela di trasformazione utilizzando provette di coltura da 15 millilitri in triplicato per ogni campione. Infine, incubare i campioni a 37 gradi Celsius agitando per 20 ore. Per misurare l'attività di tutte le legamentizzazioni della TDS beta galattotasi.

Per prima cosa, preriscalda il lettore di piastre a 28 gradi Celsius. Utilizzare il buffer Z per preparare nuove soluzioni tampone Z come descritto nel protocollo scritto. Trasferire il cloroformio tampone Z dal tubo al serbatoio, assicurandosi di convogliare solo lo strato acquoso superiore del cloroformio tampone Z.

Posizionare la piastra a 96 pozzetti su un foglio di carta con una griglia disegnata per garantire un pipettaggio accurato, trasferire 100 microlitri di cloroformio tampone Z in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, seguiti da cinque microlitri di ciascuna coltura in quad. Duplicare omettere la coltura dai quattro pozzetti che serviranno come spazi vuoti. Misurare il diametro esterno 5 95 della piastra per determinare la densità cellulare.

Aggiungere 50 microlitri di tampone Z SDS a tutti i pozzetti della piastra. Quindi agitare la piastra nel lettore di piastre per 10 minuti per limare le cellule dopo la lisi cellulare a 50 microlitri di ZPA per ONPG in tutti i pozzetti. Rimettere la piastra nel lettore di piastre e misurare OD 4 0 5 ogni 30 secondi per 20 minuti.

Determinare il livello di attività della beta lattosasi attraverso un calcolo delle unità Miller normalizzando il bianco. Il western blotting viene eseguito per verificare l'espressione proteica equivalente tra i costrutti. Per prima cosa, combinare 50 microlitri di colture triplicate e quindi centrifugare i campioni utilizzando una microcentrifuga.

Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio e risus. Sospendere il pellet residuo in due tamponi di caricamento del campione, caricare 7,5 microlitri di ciascun campione su un gel standard all'8% ed eseguire l'elettroforesi a 125 volt per un'ora e cinque minuti dopo il trasferimento. Incubare la membrana con anticorpi coniugati anti M-V-P-H-R-P per visualizzare la proteina chimerica si osserva a circa 70 kilodalton con alcuni prodotti di degradazione a volte osservati intorno ai 48 kilodalton.

La MVP endogena è stata osservata anche a 45 kilodalton. Al fine di valutare il corretto inserimento di membrana del costrutto chimerico TMD, la linea cellulare PD 28 carente della proteina legante il maltosio viene utilizzata quando viene coltivata in terreni minimi con il maltosio come unica fonte di carbonio che solo le cellule che esprimono un prodotto di espressione integrale di membrana con la proteina legante il maltosio correttamente localizzata nel periplasma possono crescere. Trasformare le cellule PD 28 come descritto per le cellule fhk 12 e inoculare due millilitri di terreno LB.

Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius con agitazione a 300 RPM durante la notte dopo l'incubazione. Pellettare le cellule mediante centrifugazione e lavare con la sospensione Resus in due millilitri di PBS e pipettaggio delicato con punta larga. Dopo la pellettatura, le celle vengono nuovamente lavate con PBS per la seconda volta, quindi eseguono una centrifugazione finale e la sospensione in un millilitro di PBS.

Utilizzare 25 microlitri di cellule risospese per inoculare cinque millilitri di terreno minimo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius agitando a 15 ore. Trasferire 200 microlitri di ciascun campione in una piastra a 96 pozzetti ed effettuare la lettura OD 5 9 5 utilizzando il lettore di piastre.

Ripeti questo processo ogni due ore fino a 25 ore. La propensione a tutte le legamentizzazioni dei singoli domini transmembrana dalla proteina integrale di membrana multis che si estende su più è stata analizzata utilizzando il saggio reporter trascrizionale tox R. Il dominio transmembrana cinque mostra una forte propensione all'aumento della liga come dimostrato da alte unità di Miller, che è paragonabile alla sequenza dimerizzante GPAA di controllo positivo ben consolidata.

Una mutazione deleteria nel dominio transmembrana cinque D uno 50 A riduce la capacità della sequenza di aumentare tutti i liga LMP uno, TM uno non aumenta significativamente tutti i liga e mostra un segnale unitario di Miller molto basso appena sopra il segnale per il bianco, che sono le cellule FHK 12 non trasformate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare se un'elica transmembrana di interesse ha la capacità di formare complessi di ordine superiore in un ambiente a membrana naturale Durante il tentativo di questa procedura, è importante pipettare con estrema attenzione nella piastra a 96 pozzetti per evitare errori di grandi dimensioni e garantire che non vengano introdotte bolle d'aria.