Caratterizzazione elettrofisiologica di GFP-Esprimendo popolazioni di cellule nella retina intatto

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le risposte alla luce e la morfologia di singoli neuroni nella retina integra utilizzando una linea di topi che esprime un marcatore fluorescente esclusivamente in specifici tipi cellulari. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando l'occhio per ottenere una retina isolata. Il secondo passaggio consiste nel posizionare la retina sotto un microscopio a scansione laser e visualizzare una cellula mediante eccitazione a due fotoni nell'infrarosso.

Una micropipetta viene quindi utilizzata per ottenere una configurazione del blocco del pezzo intero della cellula per la registrazione e il riempimento con colorante. In definitiva, questa preparazione consente la registrazione delle risposte cellulari alla stimolazione luminosa e rivela la morfologia della cellula registrata mediante microscopia confocale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la registrazione con blocco del pezzo non guidata dalla retina, è che la registrazione può essere indirizzata visivamente verso una cellula marcata fluorescentemente senza stimolare la retina con la luce di eccitazione.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella ricerca sulla retina, ad esempio qual è il contributo di una determinata popolazione cellulare nell'elaborazione delle informazioni visive? Anche nel caso in cui la popolazione cellulare abbia una bassa densità e non presenti caratteristiche morfologiche distinte che possano facilitarne l'identificazione. Iniziare questo esperimento adattando il topo al buio per almeno tre ore prima dell'esperimento.

Nel frattempo, preparare la soluzione extracellulare come descritto nel manoscritto allegato e saturarla con carbogeno a temperatura ambiente. Successivamente, sacrificare il topo e enucleare gli occhi utilizzando un paio di forbici curve per iride. Trasferirli in una capsula contenente soluzione extracellulare.

Quindi posizionarlo sotto un microscopio stereoscopico con un paio di forbici a molla. Rimuovere la cornea e il corpo ciliare aprendo il bulbo oculare lungo la ora serrata. Estrarre il cristallino e separare con attenzione la retina dall'epitelio pigmentato.

Successivamente, recidere il nervo ottico tra retina ed epitelio pigmentato. Rimuovere la retina dalla coppa oculare. Si noti che la parte interna della retina arrotolata è il lato delle cellule gangliari.

La parte esterna è il lato dei fotoricettori. Successivamente, rimuovere il vitreo dalla superficie retinica interna staccandolo delicatamente con l'aiuto di uno stuzzicadenti di legno. Quindi praticare delle brevi incisioni lungo il perimetro della retina per facilitare l'appiattimento del tessuto.

Successivamente, trasferire la retina nella camera di registrazione con il lato dei fotorecettori rivolto verso il basso. Stenderla sul fondo in vetro con un pennello sottile e immobilizzarla con un telaio in acciaio inossidabile con rete di nylon. Posizionare la camera di registrazione al buio sotto un microscopio confocale eretto a scansione laser.

Superfondere in modo continuo il preparato retinico a un flusso non inferiore a cinque millilitri al minuto. Utilizzare una soluzione extracellulare ossigenata al carburante, riscaldata a 35 gradi Celsius. Il microscopio è posizionato su un tavolo antivibrazioni a cuscino d'aria all'interno di una gabbia di Faraday. Per schermare le interferenze elettroniche, coprire la gabbia con una tenda non trasparente al fine di mantenere il preparato al buio.

Proteggiamo anche lo schermo della luce dei monitor dei computer utilizzando pellicole trasparenti rosse. Regolare il laser a infrarossi su una lunghezza d'onda compresa tra 850 e 870 nanometri o superiore. Passare alla condizione di modo bloccato e utilizzare l'eccitazione a due fotoni per visualizzare le cellule che esprimono GFP.

Per la registrazione con tecnica del patch clamp, riempire le micropipette di vetro borosilicato con la soluzione intracellulare contenente una sonda fluorescente come descritto nel manoscritto allegato. Successivamente inserire la micropipetta nel supporto. Assicurarsi che l'elettrodo di riferimento sia a contatto con la soluzione extracellulare nella camera di registrazione.

Successivamente, applicare pressione sulla cellula esprimente GFP mediante una micropipetta utilizzando un obiettivo a immersione in acqua con ingrandimento 40x; i corpi cellulari di Omicron si trovano nel livello delle cellule gangliari e nella parte prossimale del livello interno, prima che la micropipetta penetri nella membrana limitante interna sulla superficie retinica entrando in contatto con la cellula bersaglio. La penetrazione riuscita è riconoscibile dal fatto che la soluzione intracellulare viene espulsa dalla punta della micropipetta e dalla distacco della membrana limitante interna dal tessuto retinico sottostante. Il colorante fluorescente presente nella soluzione intracellulare può rivelare la posizione della micropipetta nell'immagine a due fotoni durante l'avvicinamento alla cellula desiderata.

Quindi rilasciare la pressione dalla micropipetta e ottenere una configurazione del blocco del potenziale in modalità whole cell. In modalità voltage clamp, una registrazione utilizzabile dovrebbe fornire un potenziale di membrana compreso tra meno 50 e meno 55 millivolt e durare almeno 20 minuti. Successivamente, presentare gli stimoli visivi creati su un monitor del computer.

Regolare l'intensità dello stimolo inserendo filtri neutri nel percorso del fascio e regolare la posizione spaziale dello stimolo al centro della cellula registrata. Successivamente, avviare il protocollo di stimolazione e registrare le risposte alla luce. Utilizzare il generatore di stimoli per attivare il software di registrazione.

Includere un fotodiodo all'interno del percorso del fascio per registrare i tempi dello stimolo. Fare attenzione a non estrarre il corpo cellulare durante il ritiro della micropipetta. Quando si esegue il riempimento con il colorante, lasciare che l'agente fluorescente diffonda nella cellula registrata per 30-45 minuti.

Di seguito è riportato un esempio di cellule che esprimono GFP in una preparazione piatta della retina sotto il loro promotore per la tirosina idrossilasi, in cui due popolazioni possono essere distinte in base all'intensità del segnale GFP. Le cellule dopaminergiche di tipo uno, localizzate nel livello interno, esprimono una fluorescenza debole, come indicato dalle testoline delle frecce in figura A. Le cellule di tipo due sono intensamente marcate e presentano i corpi cellulari o nel livello mostrato dalle frecce in figura A oppure spostati nel livello dei corpi cellulari gangliari, come mostrato in figura B. La figura C mostra la stratificazione dendritica delle cellule di tipo due nello strato tre del livello plessiforme interno; qui è riportato un esempio della morfologia di una cellula di tipo due iniettata con il tracciante neurobiotina.

Il tracciante è stato successivamente visualizzato mediante legame con streptavidina marcata fluorescentemente, mostrata qui in magenta. Ecco diversi schemi di risposta di una cellula di tipo due situata nel livello delle cellule gangliari alla luce bianca. È stato utilizzato uno stimolo prolungato di tre secondi per una migliore distinzione delle componenti della risposta allo stimolo, all'inizio e al termine, seguendo questa procedura.

Altri metodi come esperimenti farmacologici, imaging del calcio o immunoistochimica possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, come il ruolo funzionale di un determinato tipo cellulare nella circuitazione retinica.