Caratterizzazione elettrofisiologica di GFP-Esprimendo popolazioni di cellule nella retina intatto

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare le risposte alla luce e la morfologia di singoli neuroni nella retina intatta utilizzando una linea murina che esprime un marcatore fluorescente esclusivamente in specifici tipi di cellule. Ciò si ottiene sezionando prima l'occhio per ottenere una retina isolata. Il secondo passo consiste nel mettere la retina sotto un microscopio a scansione laser e visualizzare una cellula mediante eccitazione infrarossa a due fotoni.

Una micropipetta viene quindi utilizzata per ottenere una configurazione di patch clamp per l'intera cellula per la registrazione e il riempimento del colorante. In definitiva, questa preparazione consente di registrare le risposte cellulari alla fotostimolazione e rivela la morfologia della cellula registrata mediante microscopia confocale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la registrazione non guidata con patch clamp dalla retina è che la registrazione può essere diretta visivamente verso una cellula marcata in fluorescenza senza stimolare la retina con la luce di eccitazione.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca retinica, come ad esempio qual è il contributo di una data popolazione cellulare all'elaborazione delle informazioni visive? Anche se la popolazione cellulare ha una bassa densità e non presenta caratteristiche morfologiche distinte che possano facilitare l'identificazione. Inizia questo esperimento adattando il mouse al buio per almeno tre ore prima dell'esperimento.

Nel frattempo, preparare la soluzione extracellulare come descritto nel manoscritto allegato e farla bollire con carbogeno a temperatura ambiente. Quindi, sacrifica il topo e nuclea gli occhi con un paio di forbici dell'iride ricurve. Trasferitele in un piatto di soluzione extracellulare.

Quindi mettilo sotto un microscopio da dissezione con un paio di forbici a molla. Rimuovere la cornea e il corpo ciliare aprendo il bulbo oculare lungo l'aura serrata. Estrarre la lente e separare con cura la retina dall'epitelio pigmentato.

Successivamente, taglia il nervo ottico tra la retina e l'epitelio pigmentato. Rimuovere la retina dalla conchiglia oculare. Si noti che l'interno della retina arricciata è il lato delle cellule ganglionari.

L'esterno è il lato dei fotorecettori. Successivamente, asportare il vitreo dalla superficie retinica interna tirandolo delicatamente con l'aiuto di uno stuzzicadenti di legno. Applicare quindi brevi incisioni lungo il perimetro retinico per facilitare l'appiattimento del tessuto.

Quindi, trasferisci la retina nella camera di registrazione con il fotorecettore rivolto verso il basso. Stenderlo sul fondo del vetro con una spazzola fine e immobilizzarlo con una montatura in nylon incordata in acciaio inossidabile. Posizionare la camera di registrazione al buio sotto un microscopio a scansione laser verticale.

Super fondere il preparato retinico continuamente a non meno di cinque millilitri al minuto. Con una soluzione extracellulare ossigenata riscaldata a 35 gradi Celsius, il microscopio è situato su una tavola d'aria che assorbe gli urti all'interno di una gabbia di Faraday. Per la schermatura elettronica, coprire la gabbia con una tenda non trasparente per mantenere la preparazione e l'oscurità.

Schermamo anche la luce dai monitor dei computer con pellicole rosse trasparenti. Sintonizza il laser a infrarossi su lunghezze d'onda comprese tra 850 e 870 nanometri o più lunghe. Passa alla condizione di modalità bloccata e utilizza l'eccitazione a due fotoni per visualizzare le cellule che esprimono GFP.

Per la registrazione con pinza per patch, riempire le micropipette in vetro silicato di boro con la soluzione intracellulare contenente una sonda fluorescente come descritto nel manoscritto allegato. Quindi inserire la micropipetta nel supporto. Assicurarsi che l'elettrodo di riferimento sia a contatto con la soluzione extracellulare nella camera di registrazione.

Successivamente, applicare pressione alla cellula che esprime GFP bersaglio della micropipetta utilizzando un'immersione in acqua di 40 volte Obiettivo, i corpi cellulari Omicron sono situati nello strato di cellule gangliari e nella parte prossimale dello strato interchiaro prima che i contatti della micropipetta con la cellula bersaglio penetrino nella membrana limitante interna sulla superficie retinica. La penetrazione riuscita è riconosciuta dalla soluzione intracellulare che viene espulsa dalla punta della micropipetta e dal distacco della membrana limitante interna dal tessuto retinico sottostante. Il colorante fluorescente nella soluzione intracellulare può rivelare la posizione dei micropipetti nell'immagine a due fotoni mentre si avvicina alla cellula desiderata.

Quindi rilasciare la pressione dalla micropipetta e ottenere una configurazione di patch clamp per l'intera cellula. In modalità current clamp, una registrazione utilizzabile dovrebbe fornire un potenziale di membrana compreso tra meno 50 e meno 55 millivolt e durare per almeno 20 minuti. Successivamente, presenta gli stimoli visivi creati sul monitor di un computer.

Regolare l'intensità dello stimolo inserendo filtri a densità neutra nel percorso del raggio e regolare la posizione spaziale della stimolazione al centro della cellula registrata. Successivamente, avvia il protocollo di stimolazione e registra le risposte alla luce. Utilizzare il generatore di stimoli per attivare il software di registrazione.

Includere un fotodiodo all'interno del percorso del fascio per tenere traccia della temporizzazione dello stimolo. Fare attenzione a non estrarre il corpo cellulare quando si ritrae la micropipetta. Al termine del riempimento del colorante, lasciare che l'agente fluorescente si diffonda nella cella registrata per 30-45 minuti.

Ecco un esempio delle cellule che esprimono GFP in un montatura piatta retinica di a sotto il loro promotore Per la tirosina idrossilasi, due popolazioni possono essere distinte dalla luminosità del segnale GFP. Le cellule dopaminergiche di tipo uno situate nello strato interchiaro, esprimono una fluorescenza debole come mostrato dalle punte di freccia. Nella figura A.Le cellule di tipo due sono state intensamente marcate e hanno corpi cellulari nello strato come mostrato dalle frecce nella figura A o spostati nello strato di cellule gangliari come mostrato nella figura B, la figura C mostra una stratificazione dendritica di cellule di tipo due nello strato tre dello strato plessiforme interno mostrato qui è un esempio della morfologia di una cellula di tipo due iniettata con il tracciante neuro biotina.

Il tracciante è stato successivamente visualizzato legandosi alla streptavidina marcata in fluorescenza, che è mostrata qui in magenta. Ecco diversi modelli di risposta di una cellula di tipo due situata nello strato di cellule gangliari alla luce bianca. Uno stimolo prolungato di tre secondi è stato utilizzato per una migliore distinzione delle componenti di risposta allo stimolo, all'insorgenza e all'offset Dopo questa procedura.

Altri metodi come esperimenti farmacologici, imaging del calcio o immunochimica possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come il ruolo funzionale di un determinato tipo di cellula nei circuiti della retina.