In elettroporazione in vivo ed ex utero per l'espressione genica in cellule gangliari della retina del mouse

In utero, l'elettroporazione retinica inizia con un'incisione addominale su una diga anestetizzata di stadio E da 13,5 a 14,5 per esporre la catena embrionale. Il DNA viene iniettato in una retina per embrione e le teste vengono elettroporate, causando l'assorbimento del DNA da parte dei progenitori RGC. A E 18,5 gli embrioni sono perfusi e GFP positivi.

La retina e le proiezioni visive sono analizzate per l'elettroporazione retinica X vivo. E da 13,5 a 14,5 teste vengono fissate con il lato dorsale rivolto verso l'alto in un piatto e il DNA viene iniettato nella regione dorsale periferica di entrambe le retine, seguito dall'elettroporazione. L'intera retina viene coltivata per 40 ore, seguita da espianti retinici positivi alla piastrina GFP per i saggi di coltura in vitro.

Ciao, sono Tim Petros del laboratorio della dottoressa Carol Mason nel Dipartimento di Patologia e Biologia cellulare e neuroscienze della Columbia University. Oggi vi mostreremo come introdurre geni nella retina embrionale specchiante utilizzando l'elettroporazione retinica in utero ed ex vivo. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare come la manipolazione dell'espressione genica e delle cellule gangliari retiniche altera il loro percorso di proiezione in particolare al chiasma ottico.

Ok, iniziamo. Prima di tentare l'elettroporazione retinica in utero, è essenziale una preparazione adeguata. Si prega di consultare il nostro protocollo scritto per informazioni dettagliate sulla preparazione della sterilizzazione anestetica di strumenti e strumentazione, sulla preparazione delle soluzioni di DNA per l'iniezione e sulle soluzioni antibiotiche antimicotiche per dopo l'intervento chirurgico, sulla preparazione dell'area chirurgica e sul riscaldamento delle soluzioni adeguate.

Le micropipette a punta fine devono essere preparate prima dell'intervento chirurgico utilizzando un estrattore di micro elettrodi. Rompere la punta per creare una punta angolata per l'elettroporazione in utero Per prima cosa, iniettare 0,15 millilitri della miscela anestetica interperitoneale in una diga di stadio da E 13,5 a E 14,5. Dovrebbero essere necessari dai tre ai sette minuti prima che la diga sia completamente sotto anestesia per verificare se il topo è anestetizzato.

Pizzica la zampa posteriore e controlla la mancanza di risposta durante l'intervallo in cui l'animale soccombe all'anestetico. Tagliare un pezzettino e pipettare cinque microlitri della soluzione di DNA sul param. Piegare uno stantuffo di filo metallico con un angolo di 90 gradi e inserirlo in una micropipetta tirata utilizzando lo stantuffo, aspirare la soluzione di DNA nella micropipetta.

Ora esponi chirurgicamente gli embrioni di topo. Si prega di consultare il protocollo JoVE di Wal Inus et al per la tecnica corretta. Ora siamo pronti per l'elettroporazione.

Il primo passo è orientare correttamente la retina. Poi inietteremo il DNA nella retina e poi faremo l'electro show della testa. Ok, iniziamo.

Ok, il primo passo è orientare la retina in modo che sia rivolta verso l'alto come questa. Quindi, con la micro pipetta, foreremo la parete amniotica e idealmente inietteremo il DNA direttamente nella retina. Una volta perforata la parete uterina, premerai lo stantuffo, che espellerà il DNA nella retina e tirerà indietro lo stantuffo.

Pertanto, una volta iniettato il DNA, dovresti vedere il colorante verde riempire il liquido amniotico e anche la retina. Ok, ora che abbiamo fatto l'iniezione, siamo pronti per l'elettroporazione. Quindi, per l'elettropreghiera, posizioneremo le pale di elettroporazione attorno all'embrione con la paletta positiva adiacente alla retina che è stata elettrosfilata.

E quando è pronto, una pagaia del piede depressivo e questo fornirà corrente all'embrione. Si vedono le bolle che si formano sulla paletta della padella a carica negativa e questo dimostra che l'elettroporazione è stata un successo. E ripeterai questo passaggio per tutti gli embrioni iniettati.

Quindi è così che si fa sfilare il DNA in una retina embrionale. Puoi ripetere questa procedura fino a tutti gli embrioni che desideri. Tenendo presente che più embrioni si mettono in mostra, maggiore è la possibilità che la madre abortisca gli embrioni.

Dopo aver fatto sfilare gli embrioni, usa le dita per massaggiare la catena embrionale nella diga una volta che gli embrioni sono di nuovo dentro. Versare circa due millilitri della soluzione antibiotica anti micotica nella cavità addominale. Utilizzare l'emostatico e la pinza per suturare il peritoneo iniziando con un doppio nodo sulla parte anteriore dell'incisione e continuare in un semplice schema di sutura continua fino alla parte posteriore dell'incisione.

Utilizzare l'anello finale per legare la sutura e tagliare la sutura in eccesso. Infine, pinzare l'incisione chiusa. Per fare ciò, sollevare la pelle nella parte anteriore dell'incisione con una pinza smussata.

Fare attenzione a separare la pelle dal peritoneo. Quindi, posiziona i denti della cucitrice attorno alla pelle e per premere la cucitrice, continua a pinzare l'incisione vicino all'estremità posteriore, che di solito richiede da cinque a sette graffette. Una volta terminato, pinzando, pulire la ferita attorno alle graffette con un tampone imbevuto di alcol.

Lascia che la madre si riprenda sul termoforo e poi mettila in una nuova gabbia. Quando inizia a contrarsi e a rotolarsi, di solito impiega dai 15 ai 90 minuti per svegliarsi per ridurre al minimo il dolore e il disagio. Le madri ricevono buprenorfina al risveglio e in momenti successivi.

Se il disagio continua a prevenire la disidratazione, iniettare nella diga un millilitro di soluzione fisiologica per via sottocutanea circa due-quattro ore dopo l'intervento. Dopo 24 ore dall'intervento, la madre dovrebbe riacquistare un comportamento normale e bere e mangiare regolarmente. Raccoglieremo la retina elettroporata a E 18,5 per l'analisi.

In alternativa, è possibile lasciare che la madre partorisca e prelevare la retina in età postnatale per l'analisi in età successive. Dopo aver anestetizzato l'animale, usa le forbici per tagliare la pelle e il peritoneo sotto le graffette. Per esporre la cavità addominale e le corna uterine, rimuovere un embrione elettroporato e fissarlo attraverso gli arti a un piatto di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto, tagliare la pelle addominale e il peritoneo e tagliare le porzioni laterali della gabbia toracica per esporre il cuore.

Successivamente, forare il ventricolo sinistro con l'ago da perfusione e tagliare l'atrio destro con le micro forbici. Ora avvia la perfusione e lascia fluire il PFA per circa 60-90 secondi. Se fatto correttamente, il sangue dovrebbe uscire dall'atrio destro e l'embrione dovrebbe diventare pallido.

Una volta terminata la perfusione, decapitare l'embrione e raccogliere le teste al 4%PF in una fiala conica da 15 millilitri. Ripetere questa procedura per tutti gli embrioni elettroporati e per tutte le madri. Una volta terminata la raccolta di tutti gli embrioni, sacrificare la madre tramite lussazione cervicale.

Mantieni le teste al 4% di PFA durante la notte a quattro gradi Celsius e poi lava in PBS per diversi giorni dopo il lavaggio con PBS, ora sei pronto per esaminare la retina per un'espressione GFP di successo. Per prima cosa appuntare la testa in una capsula di dissezione con la retina rivolta verso l'alto e immersa nel PBS. Rimuovere la pelle intorno alla retina per rivelare l'epitelio pigmentato retinico o RPE utilizzando un ago calibro 26 e mezzo.

Perforare la retina ventrale alla giunzione RPE del cristallino. Quindi, inserisci un bordo delle micro forbici in questo foro e fai un'incisione verticale attraverso la retina ventrale fino al disco ottico. Questo ti permetterà di orientare la retina quando la togli.

Separare l'RPE dalla retina afferrando l'RPE in corrispondenza dell'incisione ventrale con un paio di pinze. E usa un altro paio di pinze per staccare l'RPE dalla retina, in particolare alla giunzione della lente RPE dove l'RPE è saldamente attaccato. Dopo aver rimosso l'RPE, afferrare la lente con una pinza e tirarla verso l'alto e allontanarla.

Per rimuovere la lente, rimuovere con cautela la retina posizionando una pinza sotto la retina e pizzicare la testa del nervo ottico per liberare la retina. Infine trasferire la retina in un PBS riempito. Beh, assicurati di tenere traccia della provenienza della retina, quali teste ripetono questi passaggi per la retina controlaterale e per tutti gli altri embrioni elettroporati, usa un microscopio da dissezione fluorescente per scansionare tutta la retina alla ricerca di retina positiva per GFP, il che indicherebbe che l'elettroporazione ha avuto successo in questo embrione e che la retina e il cervello corrispondente possono essere elaborati per ulteriori analisi.

La procedura di elettroporazione retinica ex vivo richiede diversi passaggi preparatori aggiuntivi che sono distinti dall'elettroporazione in utero. Si prega di consultare il protocollo scritto per informazioni dettagliate sulla preparazione e l'ossigenazione del terreno privo di siero e sulla preparazione di piastre di coltura e saggi di confine. Dopo aver anestetizzato l'animale, la cavità addominale viene aperta come precedentemente dimostrato e l'intera catena embrionale viene rimossa e posta in D-M-E-M-F 12 su ghiaccio.

La diga dovrebbe quindi essere soppressa utilizzando la lussazione cervicale. Utilizzare le forbici per tagliare la parete uterina, quindi rimuovere gli embrioni dal sacco amniotico e raccoglierli in D-M-E-M-F 12 e tenere su ghiaccio decapitare gli embrioni e tenerli in mezzo DMEA su ghiaccio i corpi possono essere scartati. Successivamente, utilizzare una pipetta per la bocca o una pipetta a stantuffo e riempire una micropipetta con la quantità desiderata di soluzione di DNA.

Quindi trasferiscine uno. Dirigiti verso un piatto di dissezione con PBS e appunta la testa con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Spostarsi nel cannocchiale di dissezione per le iniezioni.

Ok, ora siamo pronti per l'electro prate. Inietterò il DNA nella dorsale periferica di entrambe le retine e poi elettroparerò la testa. Ok, eccomi qui.

Il primo passo è rimuovere la pelle da sopra la retina. Per fare ciò, useremo le pinzette solo per staccare la pelle. Ora possiamo vedere la porzione dorsale di entrambe le retine.

Successivamente inietterò il DNA appena sotto lo strato di epitelio pigmentato retinico in entrambe le retine. Per fare ciò, terrò l'elettrodo in una posizione quasi orizzontale e forerò l'RPE nella parte dorsale più periferica della retina. Dovresti vedere il colorante verde riempire lo spazio retinico e fuoriuscire nella soluzione PBS.

Ok, ora è il momento dell'elettroporazione. Per prima cosa si sblocca la testa. Ora andremo a predare elettricamente le pale e vogliamo che la paletta positiva sia sul lato ventrale della testa.

Quindi posizioneremo la testa all'interno delle pagaie con la pagaia positiva sulla superficie ventrale e applicheremo una pressione per mantenere la pagaia ferma in questo modo. E ora andiamo alla parata elettronica. Puoi vedere le bolle che si formano sulla paletta e sulla sommità della testa.

E questo è tutto. Ora sposteremo la testa su un piatto con mediana. Questo è tutto per l'elettroporazione retinica ex vivo.

Ripeti questa procedura per tutti gli embrioni e le condizioni del DNA che desideri. Ora ci prepareremo a coltivare la retina. Dopo aver completato tutte le preparazioni elettroniche, aggiungere circa 1,5 millilitri di soluzione SFM ossigenata in un piatto a quattro pozzetti e tenerlo in ghiaccio.

Avere un pozzetto per ogni diversa soluzione di DNA iniettata. Quindi, trasferirne uno elettroporo. Dirigiti verso un piatto di dissezione con D-M-E-M-F 12 con una retina rivolta verso l'alto sulla retina ventrale o sul lato opposto alla regione bersaglio.

Usa una pinza fine per pizzicare e strappare un foro nell'RPE. Usa questo foro come punto di partenza per staccare l'RPE intorno alla retina. Non tagliare o danneggiare l'occhio in quanto ciò causerebbe il collasso della retina su se stessa durante l'incubazione.

Dopo aver rimosso l'RPE, utilizzare una pinza per estrarre la retina pizzicando il nervo ottico alla base della retina, lasciare intatto il cristallino. Trasferire la retina nell'SFM ossigenato nel piatto flip a quattro pozzetti. A testa in giù e ripetere la rimozione della retina per l'occhio controlaterale.

Completare questo passaggio per tutte le teste elettroporate e incubare la retina nella SFM ossigenata a 37 gradi Celsius per 40-48 ore. Dopo l'incubazione dell'intera retina, trasferire la retina da un pozzetto di SFM ossigenato in un coperchio di piastra di Petri con D-M-E-M-F 12. Utilizzando un cannocchiale da dissezione fluorescente, scegliere una retina e visualizzare la porzione di retina che esprime positivo la GFP.

Successivamente, utilizzando un micro bisturi e una pinza, sezionare e scartare la parte di retina non positiva alla GFP in modo che rimanga solo un pezzo di retina positivo alla GFP. È utile passare continuamente dalla luce fluorescente a quella normale durante la dissezione. Per selezionare in modo specifico la retina positiva alla GFP, trasferire il pezzo di retina positivo alla GFP in un pozzetto con G-M-E-M-F 12.

Ripetere questo passaggio per tutta la retina da un pozzetto, per ogni condizione del DNA, utilizzare una nuova piastra di Petri e un terreno D-M-E-M-F 12 per sezionare questi pezzi di retina positivi alla GFP in un explan retinico più piccolo per la placcatura. Utilizzare un cannocchiale da dissezione per tagliare il grande pezzo di retina positiva alla GFP in un explan più piccolo con un micro bisturi. L'explan dovrebbe essere di circa 200-300 micrometri di lunghezza e larghezza.

Un pezzo di retina positivo alla GFP dovrebbe produrre da quattro a 10 explan retinico positivo GFP Raccogli tutto l'explan in un pozzetto con D-M-E-M-F 12. Ripetere questo passaggio per tutte le regioni retiniche positive alla GFP che vengono raccolte. Dopo aver preparato tutti i GFP positivi alla retina, aggiungere 250 microlitri di SFM freddo più lo 0,4% di metilcellulosa alle piastre di coltura rivestite in laminato.

Quindi, trasferire da quattro a otto explan positivi GFP sulla piastra di coltura e utilizzare le pinze per disporre delicatamente l'explan X in un poligono con x explan situato a metà strada tra il centro e il bordo della piastra. Determina quale lato dell'explan X è il layer RGC. Questo può essere fatto cercando cristalli di RPE, che a volte possono rimanere attaccati allo strato retinico esterno, indicando che il lato opposto è lo strato RGC.

Il lato RGC di solito ha anche alcuni detriti cellulari che possono aiutare nella spiegazione corretta con lo strato RGC verso il basso. Utilizzare una pinza per premere con decisione il centro dell'explan in modo che aderisca al vetrino coprioggetto sulla base del piatto di coltura. Dopo aver impiattato tutto l'X su un piatto di coltura, trasferirlo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.

Gli espianti di X retinici mostrano un'abbondante crescita degli assoni dopo 24 ore e possono essere utilizzati per numerosi saggi in vitro, quindi fissati con PFA al 4% per 30 minuti. E immuno colorante per il test di confine. Trasferire l'explan positivo 4G FP su una piastra che è stata preparata per il saggio di confine.

Disponi gli espianti X in una linea retta che si avvicini al bordo fluorescente con il substrato di interesse. Sotto un microscopio da dissezione a fluorescenza, utilizzare una pinza per placcare l'EXPLAN in modo che si trovi a circa 50-150 micrometri dal bordo fluorescente. Alternanza tra i due canali fluorescenti per visualizzare la planata verde e il bordo rosso.

Successivamente, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 24 ore, lasciando ampio tempo agli assoni RGC di raggiungere il substrato di confine. X explan può quindi essere fissato in PFA al 4% per 30 minuti, seguito da immunocolorazione. A seguito di elettroporazione retinica in utero.

I montaggi dei fori retinici possono essere preparati per visualizzare i GC R positivi alla GFP nella retina e semiintatti. I sistemi visivi possono essere preparati per visualizzare gli assoni positivi alla GFP in tutto il nervo ottico, il chiasma ottico e il tratto ottico. In alternativa, le sezioni criogeniche frontali possono essere effettuate attraverso la retina e la via RGC per visualizzare e analizzare i corpi cellulari RGC positivi alla GFP nella retina e gli assoni nel chiasma e nel tratto del nervo ottico.

Tutti gli assoni retinici sono visualizzati con la colorazione dei neurofilamenti. Inoltre, in utero, l'elettroporazione può essere utilizzata per studiare il targeting degli assoni RGC nel nucleo geniale laterale LGN, raccogliendo cuccioli da P 4 a P 10. A P otto assoni GFP positivi sono visibili nell'LGN con CTB LOR 5 94 canale rosso iniettato nella retina omolaterale e CT bor 6 47 canale blu nella retina controlaterale per marcare l'intera proiezione RGC dopo elettroporazione ex vivo e placcatura di impianti retinici.

Un sottoinsieme di assoni RGC RGFP positivo e può essere chiaramente visualizzato sia a potenza inferiore che superiore, come si vede rispettivamente nelle immagini in alto e in basso. La risposta degli assoni positivi alla GFP può essere analizzata placcando XS adiacente ai bordi dei vari substrati mostrati qui in blu. Vi abbiamo appena mostrato come introdurre geni nella retina embrionale specchiante utilizzando l'elettroporazione retinica in utero ed ex vivo.

Sebbene abbiamo concentrato la nostra analisi sulla guida assonale del chiasma ottico, questa tecnica potrebbe essere utile per coloro che studiano la differenziazione RGC, la morfologia dendritica e le proprietà elettrofisiologiche delle cellule gangliari retiniche. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di ridurre al minimo il danno alla retina durante l'iniezione del DNA e di mantenere sempre gli embrioni idratati con PBS durante l'esperimento. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.