Name: In elettroporazione in vivo ed ex utero per lespressione genica in cellule gangliari della retina del mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 6 s
Description: Scopri l'elettroporazione in utero ed ex vivo per manipolare l'espressione genica nelle cellule gangliari della retina del mouse. Questo metodo permette di studiare lo sviluppo retinico e le proprietà funzionali dei RGC.

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Ringraziamo il Dr. Richard Vallee e Brikha Shrestha per aiutare con il in utero ed ex tecniche di elettroporazione in vivo della retina, rispettivamente, e il dottor T. Sakurai dei commenti a questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Borse Salute F31 NS051008 (TJP), la Fondation pour la Recherche Medicale, e lo Human Frontier Science Program (AR) e R01 EY12736 (CM).

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Eye+Retina+and+the+Visual+Systems+of+the+Mouse%22">Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse</a>. Chalupa, L. M., Williams, R. W. , MIT Press. Cambridge. (2008).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li>
<li>Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sufficiency+of+EphB1+in+driving+the+ipsilateral+retinal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection.</a> J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).</li>
</ol>

In questo video, abbiamo dimostrato tecniche di elettroporazione, sia in utero ed ex vivo, per la consegna gene in embrioni murini RGCs. In utero elettroporazione retina fornisce un meccanismo per la manipolazione dell&#39;espressione genica in RGCs e visualizzare le loro proiezioni degli assoni in vivo. Permettendo gli embrioni permette di sopravvivere dopo la nascita esame di tali GFP + proiezioni RGC nella loro target, il nucleo genicolato laterale (LGN). Ex elettroporazione in vivo della retina fornisce una capacità più controllato a specifici target regioni della retina per l&#39;uso con saggi in vitro. Combinando in vivo e in vitro, analisi derivanti da queste tecniche permette di caratterizzazione approfondita dello sviluppo RGC e proiezioni assonale in un sottogruppo di RGCs in un contesto altrimenti normale. Mentre la nostra manifestazione si concentra sulla guida RGC assoni a livello del chiasma ottico, sia in utero ed ex electroporations vivo della retina potrebbe essere utile per studiare come perturbazioni nella differenziazione effetto espressione genica RGC, morfologia dendritiche, le proprietà elettrofisiologiche, formazione di sinapsi e propria targeting nelle zone di tale risoluzione come LGN e collicolo superiore.

<table><tbody><tr><td>BTX Electro Square Porator ECM 830 (con pedale a pressione)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi a pinza rotondi</td><td>Nepa Gene</td><td>CUY650-5 o CUY650-7</td><td></td></tr><tr><td>Suture in seta</td><td>Henry Schein</td><td>101-2636</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette di vetro con stantuffo</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-antimicotico</td><td>Invitrogen</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo DMEM/F12</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>Supplemento ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1884</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Piastre con fondo in vetro e micropozzetti</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr></tbody></table>

in elettroporazione in vivo ed ex utero per l&#39;espressione genica in cellule gangliari della retina del mouse

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

La retina e il suo unico neurone di output, le cellule gangliari della retina (RGC), costituiscono un ottimo modello per esaminare questioni biologiche, come la differenziazione cellulare, l&#39;orientamento degli assoni, organizzazione e formazione di sinapsi retinotopica [1]. Uno svantaggio è l&#39;impossibilità di manipolare in modo efficiente e affidabile in RGCs espressione genica in vivo, soprattutto nei percorsi murino altrimenti accessibile visiva. Topi transgenici possono essere utilizzati per manipolare l&#39;espressione genica, ma questo approccio è spesso costoso, richiede tempo, e può produrre effetti collaterali indesiderati. In pulcino, in elettroporazione ovo è usato per manipolare l&#39;espressione genica in RGCs per l&#39;esame della retina e lo sviluppo RGC. Sebbene le tecniche di elettroporazione simili sono state sviluppate in cuccioli di topo neonatale [2], ratti adulti [3], e la retina embrionale murino in vitro [4], nessuna di queste strategie permettono caratterizzazione completa dello sviluppo RGC e proiezioni degli assoni in vivo. A tal fine, abbiamo sviluppato due applicazioni di elettroporazione, una in utero e gli altri ex vivo, in maniera specifica RGCs embrionale murino [5, 6]. Con elettroporazione in utero della retina, possiamo misexpress o downregulate geni specifici in RGCs e seguire le loro proiezioni assone attraverso le vie visive in vivo, che consente l&#39;esame delle decisioni di orientamento a obiettivi intermedi, come il chiasma ottico, o in regioni-obiettivo, come il nucleo genicolato laterale. Perturbante espressione genica in un sottogruppo di RGCs in uno sfondo altrimenti wild-type facilita la comprensione della funzione genica in tutto il percorso della retina. Inoltre, abbiamo sviluppato una tecnica compagno per analizzare la crescita degli assoni RGC in vitro. Noi electroporate embrionale teste ex vivo, raccogliere e incubare la retina intero, quindi preparare espianti di retina in questi giorni più tardi. Espianti di retina può essere utilizzato in una varietà di test in vitro al fine di esaminare la risposta del elettroporate assoni RGC ai segnali di guida o altri fattori. In sintesi, questo insieme di tecniche migliora la nostra capacità di misexpress o downregulate geni RGCs e dovrebbero grande aiuto studi che hanno esaminato lo sviluppo RGC e proiezioni assone.

Qui vi presentiamo due tecniche per la manipolazione dell&#39;espressione genica nel topo cellule gangliari della retina (RGCs) da<em&gt; In utero</em&gt; E<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elettroporazione. Queste tecniche permettono di esaminare come le alterazioni nell&#39;espressione genica influenzano lo sviluppo RGC, l&#39;orientamento degli assoni, e le proprietà funzionali.

In elettroporazione in vivo ed ex utero per l&#39;espressione genica in cellule gangliari della retina del mouse

La retina e l'unico neurone di uscita, la cellula gangliare della retina (RGC), costituiscono un modello eccellente per esaminare questioni biologiche quali la cellula...

In utero, l'elettroporazione retinica inizia con un'incisione addominale su una femmina anestetizzata allo stadio E 13,5-14,5 per esporre la catena embrionale. Il DNA viene iniettato in una retina per ogni embrione e le teste vengono sottoposte a elettroporazione, inducendo il trasferimento del DNA nei progenitori delle cellule gangliari retiniche (RGC). A 18,5 d.e., gli embrioni vengono perfusi e risultano positivi per GFP.La retina e le proiezioni visive vengono analizzate per l'elettroporazione retinica ex vivo. Le teste di embrioni E 13,5-14,5 vengono fissate con la faccia dorsale verso l'alto in una piastra e il DNA viene iniettato nella regione dorsale periferica di entrambe le retine, seguito da elettroporazione. Le retine intere vengono coltivate per 40 ore, quindi gli espanti retinici positivi per GFP vengono seminati per saggi di coltura in vitro.Ciao, sono Tim Petros del laboratorio della dottoressa Carol Mason del Dipartimento di Patologia e biologia cellulare e neuroscienze presso la Columbia University. Oggi vi mostreremo come introdurre geni nella retina di embrioni in via di sviluppo utilizzando l'elettroporazione retinica in utero ed ex vivo. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare in che modo la manipolazione dell'espressione genica nelle cellule gangliari retiniche alteri il loro tragitto di proiezione, in particolare al chiasma ottico.Ok, iniziamo. Prima di tentare l'elettroporazione retinica in utero, è essenziale una corretta preparazione. Si prega di consultare il nostro protocollo scritto per informazioni dettagliate sulla preparazione dell'anestetico, sulla sterilizzazione di strumenti e apparecchiature, sulla preparazione delle soluzioni di DNA per l'iniezione e delle soluzioni antibiotiche antimicotiche da utilizzare dopo l'intervento chirurgico, sull'allestimento dell'area operatoria e sul riscaldamento delle soluzioni appropriate.Le micropipette con punta fine devono essere preparate prima dell'intervento chirurgico utilizzando un estrattore di microelettrodi. Rompere la punta per ottenere un'estremità angolata per l'elettroporazione in utero. Iniettare prima 0,15 millilitri della miscela anestetica per via intraperitoneale in una femmina allo stadio E 13,5-E 14,5. Devono trascorrere da tre a sette minuti affinché l'anestesia faccia pieno effetto; per verificare che il topo sia correttamente anestetizzato.Pizzicare la zampa posteriore e verificare l'assenza di risposta durante l'intervallo in cui l'animale sta perdendo conoscenza a causa dell'anestetico. Tagliare un piccolo pezzo e pipettare cinque microlitri della soluzione di DNA sul param. Piegate un'asticella metallica ad angolo retto e inseritela in una micropipetta tirata; utilizzando l'asticella, aspirare la soluzione di DNA nella micropipetta.Ora esporre chirurgicamente gli embrioni di topo. Si prega di consultare il protocollo JoVE di Wal Inus et al. per la tecnica corretta. Ora siamo pronti per l'elettroporazione.Il primo passo consiste nell'orientare correttamente la retina. Successivamente inietteremo il DNA nella retina e poi sottoporremo la testa a elettroporazione. Bene, cominciamo.Ok, il primo passo consiste nell'orientare la retina in modo che sia rivolta verso l'alto, come in questo caso. Successivamente, con la micropipetta, si perfora la parete amniotica e, idealmente, si inietta il DNA direttamente nella retina. Una volta perforata la parete uterina, si preme lo stantuffo, che espelle il DNA all'interno della retina, quindi si ritrae lo stantuffo.Pertanto, una volta iniettato il DNA, si dovrebbe vedere il colorante verde riempire il liquido amniotico e anche la retina. Bene, ora che abbiamo effettuato l'iniezione, siamo pronti per l'elettroporazione. Per elettroporare, posizioneremo le piastre dell'elettroporatore attorno all'embrione con la piastra positiva adiacente alla retina che è stata elettroporata.E quando pronto, applicare un impulso elettrico con una punta depressiva, che invierà la corrente all'embrione. Si osserveranno bolle formarsi sulla punta carica negativamente, indicando che l'elettroporazione è avvenuta con successo. Ripetere questo passaggio per tutti gli embrioni iniettati.In questo modo si elettropora il DNA in una retina embrionale. È possibile ripetere questa procedura su quanti embrioni si desidera. Tuttavia, è importante tenere presente che più embrioni si sottopongono a elettroporazione, maggiore sarà la probabilità che la madre abortisca gli embrioni.Dopo aver elettroporato gli embrioni, utilizzare le dita per massaggiare la catena embrionale riportandola all'interno della femmina una volta che gli embrioni sono stati reinseriti. Versare circa due millilitri della soluzione antibiotica antimicotica nella cavità addominale. Utilizzare l'emostatico e la pinza per suturare il peritoneo, iniziando con un nodo doppio nella porzione anteriore dell'incisione e proseguendo con un punto continuo semplice fino alla porzione posteriore dell'incisione.Utilizzare l'ultimo cappio per fissare il punto e tagliare l'eccesso di sutura. Infine, chiudere l'incisione con punti metallici. Per fare ciò, sollevare la pelle nella porzione anteriore dell'incisione con pinze ottuse.Attenzione a separare la pelle dal peritoneo. Successivamente, posizionare i denti dello sparachiodi attorno alla pelle e premere lo sparachiodi, continuando a chiudere l'incisione con chiodi fino all'estremit&agrave; posteriore, operazione che di solito richiede da cinque a sette chiodi. Al termine, pulire la ferita attorno ai chiodi con un batuffolo di alcol.Lasciare che la femmina si riprenda sulla piastra riscaldante, quindi posizionarla in una nuova gabbia. Quando inizia a fremere e a girarsi, di solito passano da 15 a 90 minuti prima che si risvegli completamente, al fine di minimizzare dolore e disagio. Le madri ricevono buprenorfina al risveglio e in successivi momenti temporali.Se il disagio persiste fino a impedire la disidratazione, iniettare alla madre un millilitro di soluzione salina per via sottocutanea circa due-quattro ore dopo l'intervento chirurgico. Dopo 24 ore dall'intervento, la madre dovrebbe riprendere un comportamento normale e bere e mangiare regolarmente. Raccoglieremo la retina elettroporata a E 18,5 per l'analisi.In alternativa, è possibile lasciare che la femmina partorisca e raccogliere la retina a età postnatale per l'analisi a età successive. Dopo aver anestetizzato l'animale, utilizzare le forbici per tagliare la pelle e il peritoneo al di sotto delle graffette. Per esporre la cavità addominale e le corna uterine, rimuovere un embrione elettroporato e fissare l'embrione attraverso gli arti a un piatto da dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto; tagliare la pelle addominale e il peritoneo e proseguire tagliando le porzioni laterali della gabbia toracica per esporre il cuore.Successivamente, perforare il ventricolo sinistro con l'ago di perfusione e tagliare l'atrio destro con le forbici microchirurgiche. Ora avviare la perfusione e lasciare scorrere il PFA per circa 60-90 secondi. Se eseguito correttamente, il sangue dovrebbe fuoriuscire dall'atrio destro e l'embrione dovrebbe diventare pallido.Al termine della perfusione, decapitare l'embrione e raccogliere le teste in PF al 4% in un vial conico da 15 millilitri. Ripetere questa procedura per tutti gli embrioni elettroporati e per tutte le femmine gravide. Dopo aver raccolto tutti gli embrioni, sacrificare la femmina mediante dislocazione cervicale.Mantenere le teste in PFA al 4% durante la notte a quattro gradi Celsius, quindi lavarle in PBS per diversi giorni; dopo il lavaggio con PBS, si è pronti per esaminare la retina per verificare un'espressione riuscita di GFP. Innanzitutto, fissare la testa in una bacinella per dissezione con la retina rivolta verso l'alto e immersa in PBS. Rimuovere la pelle intorno alla retina per esporre l'epitelio pigmentato retinico o RPE utilizzando un ago da 26 e mezzo.Perforare la retina ventrale al giunzione tra lente ed epitelio pigmentato retinico (RPE). Successivamente, inserire un bordo delle forbici microchirurgiche in questo foro ed eseguire un'incisione verticale attraverso la retina ventrale fino al disco ottico. Questo permetterà di orientare la retina quando la si rimuove.Separare l'epitelio pigmentato retinico dalla retina afferrando l'EPR all'incisione ventrale con una pinzetta. Utilizzare un'altra pinzetta per staccare l'EPR dalla retina, in particolare alla giunzione EPR-cristallino dove l'EPR è saldamente attaccato. Dopo aver rimosso l'EPR, afferrare il cristallino con la pinzetta e tirare verso l'alto e all'esterno.Per rimuovere il cristallino, rimuovere con attenzione la retina posizionando la pinzetta sotto la retina e pizzicando la testa del nervo ottico per staccare la retina. Trasferire infine la retina in una pozzetta riempita di PBS. Assicurarsi di tenere traccia da quale testa proviene ogni retina. Ripetere questi passaggi per la retina controlaterale e per tutti gli altri embrioni elettroporati. Utilizzare un microscopio stereoscopico a fluorescenza per esaminare tutte le retine alla ricerca di retine positive per GFP, il che indicherebbe che l'elettroporazione è stata efficace in questo embrione e che queste retine e i corrispondenti cervelli possono essere sottoposti ad ulteriori analisi.La procedura di elettroporazione retinica ex vivo richiede diversi passaggi preparatori aggiuntivi che differiscono dall'elettroporazione in utero. Si prega di consultare il protocollo scritto per informazioni dettagliate sulla preparazione e ossigenazione del mezzo privo di siero e sulla preparazione delle piastre per colture e dei saggi con barriera. Dopo aver anestetizzato l'animale, la cavità addominale viene aperta come precedentemente dimostrato e l'intera catena embrionale viene rimossa e posta in D-M-E-M-F 12 su ghiaccio.La femmina deve quindi essere sottoposta a eutanasia mediante dislocazione cervicale. Utilizzare le forbici per tagliare la parete uterina, quindi rimuovere gli embrioni dalla sacca amniotica e raccoglierli in D-M-E-M-F 12, mantenendoli sul ghiaccio; decapitare gli embrioni e conservarli in mezzo DMEA sul ghiaccio; i corpi possono essere scartati. Successivamente, utilizzare una pipetta a bocca o una pipetta con pistone e riempire una micropipetta con la quantità desiderata di soluzione di DNA.Quindi trasferirne uno in una capsula di Petri per dissezione contenente PBS e fissare la testa con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Passare al microscopio stereoscopico per le iniezioni.Bene, ora siamo pronti per l'elettroporazione. Inietterò il DNA nella regione dorsale periferica di entrambe le retine e poi sottoporrò la testa a elettroporazione. Bene, ecco che inizio.Il primo passo consiste nel rimuovere la pelle sopra la retina. Per fare ciò, utilizzeremo le pinzette per staccare delicatamente la pelle. Ora possiamo vedere la porzione dorsale di entrambe le retina.Successivamente inietterò il DNA appena al di sotto del livello dell'epitelio pigmentato retinico in entrambe le retine. Per fare ciò, terrò l'elettrodo in una posizione quasi orizzontale e lo inserirò attraverso l'epitelio pigmentato retinico nella parte dorsale più periferica della retina. Dovreste vedere il colorante verde riempire lo spazio retinico e fuoriuscire nella soluzione di PBS.Ok, ora è il momento dell'elettroporazione. Prima di tutto si rimuove il perno dalla testa. Ora applicheremo i paddles elettrici e vogliamo che il paddle positivo sia posizionato sul lato ventrale della testa.Posizioneremo quindi la testa tra le piastre, con la piastra positiva sulla superficie ventrale, e applicheremo pressione per mantenere ferma la piastra in questo modo. Ora procederemo con l'elettroporazione. Si possono osservare le bolle che si formano sulla piastra e sulla sommità della testa.E questo è tutto. Ora sposteremo la testa in una piastra con mezzo. Questo conclude l'elettroporazione retinica ex vivo.Ripetere questa procedura per un numero qualsiasi di embrioni e condizioni di DNA desiderato. Ora ci prepariamo a coltivare la retina. Dopo aver completato tutte le preparazioni elettro, aggiungere circa 1,5 millilitri di soluzione SFM ossigenata in una piastra a quattro pozzetti e mantenerla sul ghiaccio.Utilizzare un pozzetto per ogni diversa soluzione di DNA iniettata. Successivamente, trasferire un elettroporato. Procedere verso una piastra per dissezione contenente D-M-E-M-F 12 con una retina rivolta verso l'alto sulla retina ventrale o sul lato opposto alla regione bersaglio.Usare pinzette fini per pizzicare e strappare un foro nell'epitelio pigmentato della retina (RPE). Utilizzare questo foro come punto di partenza per staccare l'RPE attorno alla retina. Non tagliare né danneggiare l'occhio, poiché ciò causerebbe il collasso della retina su se stessa durante l'incubazione.Dopo aver rimosso l'epitelio pigmentato retinico (RPE), utilizzare pinzette per staccare la retina pinzando il nervo ottico alla base della retina, lasciando intatto il cristallino. Trasferire la retina nel mezzo salino privo di siero (SFM) ossigenato contenuto nella piastra a quattro pozzetti, capovolgendo delicatamente. Procedere quindi con la rimozione della retina dall'occhio controlaterale.Completare questo passaggio per tutte le teste elettroporate e incubare la retina nel mezzo SFM ossigenato a 37 gradi Celsius per 40-48 ore. Dopo l'incubazione della retina intera, trasferire la retina da un pozzetto di mezzo SFM ossigenato in un coperchio di piastra di Petri contenente D-M-E-M-F 12. Utilizzando un microscopio fluorescente per dissezione, selezionare una retina e visualizzare la porzione positiva per l'espressione di GFP.Successivamente, utilizzando un microbisturi e una pinzetta, dissezionare e scartare la porzione di retina non positiva per GFP in modo che rimanga soltanto un frammento di retina positivo per GFP. È utile passare continuamente tra luce fluorescente e luce normale durante tutta la dissezione. Per selezionare in modo specifico la retina positiva per GFP, trasferire il frammento di retina positivo per GFP in una pozzetta contenente G-M-E-M-F 12.Ripetere questo passaggio per tutte le retine provenienti da un singolo pozzetto; per ogni condizione di DNA, utilizzare una nuova piastra di Petri e mezzo D-M-E-M-F 12 per dissezionare questi frammenti retinici positivi per GFP in espiananti retinici più piccoli da piastrare. Utilizzare un microscopio stereoscopico per tagliare il frammento più grande di retina positiva per GFP in espiananti più piccoli mediante un microbisturi. Gli espiananti dovrebbero avere una lunghezza e larghezza di circa 200-300 micrometri.Un frammento positivo per GFP della retina dovrebbe produrre circa da quattro a dieci espianti retinici positivi per GFP. Raccogliere tutti gli espianti in una pozzetta con D-M-E-M-F 12. Ripetere questo passaggio per tutte le regioni retiniche positive per GFP che vengono raccolte. Dopo aver preparato tutti gli espianti retinici positivi per GFP, aggiungere 250 microlitri di SFM freddo più 0,4% di metilcellulosa in piatti da coltura rivestiti con laminina.Successivamente, trasferire da quattro a otto espianzioni GFP positive nella piastra di coltura e utilizzare la pinzetta per disporre delicatamente gli espianzioni X in una forma poligonale, posizionando gli espianzioni X a metà strada tra il centro e il bordo della piastra. Determinare quale lato degli espianzioni X corrisponde al livello delle cellule gangliari retiniche (RGC). Questo può essere fatto cercando i cristalli di epitelio pigmentato retinico (RPE), che a volte possono rimanere attaccati al livello retinico esterno, indicando che il lato opposto è il livello RGC.Anche il lato delle cellule gangliari della retina (RGC) presenta solitamente alcuni detriti cellulari che possono facilitare la corretta posizione con lo strato di RGC rivolto verso il basso. Utilizzare la pinzetta per premere con fermezza al centro dell'espianto in modo che aderisca al vetrino coprioggetto alla base della piastra di coltura. Dopo aver seminato tutti gli X espianti su una piastra di coltura, trasferire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius.Gli espianti retinici X mostrano una crescita assonica abbondante dopo 24 ore e possono essere utilizzati per numerose analisi in vitro, quindi fissati con PFA al 4% per 30 minuti. E colorazione immunoistochimica per il saggio del confine. Trasferire l'espianto positivo per 4G FP in una piastra precedentemente preparata per il saggio del confine.Disporre gli espianti X in una linea retta che approssimi il bordo fluorescente con il substrato di interesse. Sotto un microscopio stereoscopico fluorescente, utilizzare pinzette per piastrare gli EXPLAN in modo che si trovino a circa 50-150 micrometri dal bordo fluorescente. Alternare tra i due canali fluorescenti per visualizzare l'espianto verde e il bordo rosso.Successivamente, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 24 ore, consentendo un tempo sufficiente affinché gli assoni delle cellule gangliari della retina raggiungano il substrato di confine. X explan può quindi essere fissato in PFA al 4% per 30 minuti, seguito da colorazione immunoistochimica. Dopo l'elettroporazione retinica in utero.È possibile preparare montaggi con foro retinico per visualizzare i RGC positivi per GFP nella retina e nel sistema visivo semi-intatto. I sistemi visivi possono essere preparati per visualizzare gli assoni positivi per GFP lungo il nervo ottico, il chiasma ottico e il tratto ottico. In alternativa, si possono ottenere sezioni crio-frontali attraverso la retina e il percorso dei RGC per visualizzare e analizzare i corpi cellulari dei RGC positivi per GFP nella retina e gli assoni nel nervo ottico, chiasma e tratto.Tutti gli assoni retinici sono visualizzati mediante colorazione per neurofilamenti. Inoltre, l'elettroporazione in utero può essere utilizzata per studiare il targeting degli assoni delle cellule gangliari della retina (RGC) nel nucleo genicolato laterale (LGN), raccogliendo i cuccioli tra il giorno postnatale 4 e il giorno postnatale 10. Al giorno postnatale 8, gli assoni positivi per GFP sono visibili nel LGN, con CTB LOR 5 94 nel canale rosso iniettato nella retina ipsilaterale e CT bor 6 47 nel canale blu iniettato nella retina controlaterale, al fine di etichettare l'intera proiezione delle RGC dopo elettroporazione ex vivo e piastramento di innesti retinici.Un sottoinsieme di assoni delle cellule gangliari della retina positivi per RGFP può essere chiaramente visualizzato sia a ingrandimento minore che maggiore, come mostrato rispettivamente nelle immagini superiore e inferiore. La risposta degli assoni positivi per GFP può essere analizzata piantando XS adiacenti ai bordi di vari substrati mostrati qui in blu. Vi abbiamo appena mostrato come introdurre geni nella retina embrionale mediante elettroporazione retinica in utero ed ex vivo.Mentre abbiamo concentrato la nostra analisi sulla guida degli assoni al chiasma ottico, questa tecnica potrebbe risultare utile per chi studia la differenziazione delle cellule gangliari retiniche (RGC), la morfologia dendritica e le proprietà elettrofisiologiche delle cellule gangliari della retina. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di minimizzare i danni alla retina durante l'iniezione del DNA e di mantenere sempre gli embrioni idratati con PBS per tutta la durata dell'esperimento. Ecco tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Pulcino colture di cellule della retina embrionali costituiscono validi strumenti per lo studio della biologia dei fotorecettori. Abbiamo sviluppato una tecnica di trasferimento genico efficace sulla base di ex ovo plasmide elettroporazione delle retine precedenti alla cultura. Questa tecnica aumenta considerevolmente l'efficienza di transfezione su protocolli attualmente disponibili, rendendo la manipolazione genetica fattibile per questo sistema.

Trasferimento efficiente Gene in Chick retine per cellulari primarie Cultura Studies: An Ex-ovo Elettroporazione Approach

Abbiamo sviluppato un nuovo approccio di perdita di funzione che prevede l'introduzione e l'integrazione genomica di sequenze di micro-RNA artificiali in embrioni di pulcino utilizzando l'elettroporazione in ovo e il sistema di trasposoni Tol2. Questa tecnica fornisce una metodologia di knockdown genico robusta e stabile per gli studi sulla funzione genica durante lo sviluppo.

Approccio alla perdita di funzione nella retina embrionale del pulcino utilizzando l'espressione transgenica mediata dal trasposone Tol2 di microRNA artificiali

Scopri l'elettroporazione in utero ed ex vivo per manipolare l'espressione genica nelle cellule gangliari della retina del mouse. Questo metodo permette di studiare lo sviluppo retinico e le proprietà funzionali dei RGC.

In elettroporazione in vivo ed ex utero per l'espressione genica in cellule gangliari della retina del mouse

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