Name: Trasduzione di cellule umane con Polymer-complessato Lentivirus Ecotropic per Enhanced biosicurezza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: Scopri la trasduzione di cellule umane con lentivirus ecotropo e complessazione polimerica per introdurre oncogeni in sicurezza. Questo metodo migliora l'efficienza e riduce i rischi rispetto ai lentivirus pantropi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il finanziamento per questo progetto è stato fornito dal California Institute per la Medicina Rigenerativa.

1. Produzione, raccolta e congelamento del lentivirus
<ol>
	<li>Consultare l'addetto alla sicurezza istituzionale prima di iniziare questo protocollo e seguire le linee guida sulla sicurezza da lui raccomandate.</li>
	<li>Giorno 1. Iniziare con cellule 293T sane e in rapida crescita per produrre il virus. Seminare le cellule a 5 x 106 cellule per piastra da 10 cm. Utilizzare mezzo per cellule 293T senza antibiotici (DMEM ad alto contenuto di glucosio con 10% di FBS e 4 mM di L-glutammina) per la produzione del virus.</li>
	<li>Giorno 2. Nel tardo pomeriggio, trasfettare le cellule 293T come segue (i valori indicati si riferiscono a una singola piastra da 10 cm). Lasciare che tutti i reagenti raggiungano la temperatura ambiente. Pipettare 375 μl di OptiMEM in una provetta da microcentrifuga, quindi aggiungere 25 μl di Fugene HD. Evitare che il Fugene non diluito entri in contatto con la superficie della provetta.</li>
	<li>In una provetta da microcentrifuga, mescolare:
		<ul>
			<li>5 μg di plasmide trasferibile (Slc7a1, vettore bersaglio o vettore di controllo fluorescente)</li>
			<li>3,75 μg di plasmide di impacchettamento (pCMV-dR8.91 o psPax2)</li>
			<li>1,25 μg di plasmide dell'involucro (pMD2.G per tropismo pantropico, pHCMV-EcoEnv per tropismo ecotropico)</li>
			<li>OptiMEM senza siero fino a un volume finale di 100 μl</li>
		</ul>
	</li>
	<li>Unire i contenuti delle due provette e incubare la miscela per 20-30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cambiare il mezzo sulle cellule 293T con 10 ml di mezzo fresco senza antibiotici. Aggiungere la miscela di Fugene/plasmidi goccia a goccia sulla piastra e incubare tutta la notte a 37°C, 5% CO2.</li>
	<li>Giorno 3. Cambiare il mezzo sulle cellule 293T con 10 ml di mezzo fresco senza antibiotici. Procedere con delicatezza, poiché le cellule 293T aderiscono in modo debole e possono staccarsi se il mezzo viene pipettato con troppa forza sul monostrato. Incubare per due giorni in un'incubatrice umidificata per la produzione del virus.</li>
	<li>Giorno 5. Raccogliere il virus e filtrarlo attraverso un filtro con bassa capacità di legame alle proteine da 0,45 mm. Utilizzarlo immediatamente oppure suddividerlo in aliquote monouso e congelarlo a -80°C. Il virus pantropico e il virus ecotropico congelati devono essere rititolati dopo sei mesi e un mese di conservazione, rispettivamente.</li>
	<li>Titolare il virus come segue, utilizzando cellule relativamente suscettibili alla trasduzione. Trasdurre le cellule con il virus di controllo fluorescente durante la notte usando diluizioni seriali (ad esempio 1:10, 1:100, 1:1000) in mezzo fresco con 6 μg/ml di PB. Il giorno successivo, sostituire con mezzo fresco. Attendere due giorni dopo la trasduzione affinché le cellule inizino a esprimere la proteina fluorescente, quindi determinare la frazione di cellule trasdotte mediante FACS. Calcolare la titolazione in unità trasformanti (TU) per ml, basandosi sulle diluizioni che producono &lt; 15% di trasduzione per minimizzare eventi di trasduzione multipla. 
	<img src="/files/ftp_upload/2822/2822eq1.jpg" alt="Formula per il calcolo della titolazione, equazione per la quantificazione del virus, analisi matematica in virologia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 1">
	</li>
</ol>
2. Trasduzione di cellule bersaglio umane con il recettore del retrovirus murino Slc7a1
<ol>
	<li>Selezionare una multiplicità di infezione (MOI) = 2 per garantire che la maggior parte delle cellule venga transdotta. Per cellule bersaglio resistenti alla transduzione, come gli HDF, sarà necessaria una MOI più elevata; noi diluiamo il supernatante virale solo 1:2 per ottenere la transduzione della maggioranza delle cellule.</li>
	<li>Transdurre le cellule bersaglio durante la notte con il supernatante virale diluito in mezzo di coltura fresco contenente 6 μg/ml di PB, che aumenta la transduzione potenziando l'interazione elettrostatica tra il virus e la cellula bersaglio.1 Idealmente, si dovrebbe utilizzare un volume minimo di virus, ad esempio 1 ml per una piastra da 35 mm, poiché la diffusione rappresenta un fattore limitante per l'efficienza di transduzione.</li>
	<li>Coltivare le cellule per almeno 48 ore dopo la rimozione del virus prima di transdurle con virus ecotropo, al fine di assicurare un'espressione sufficiente del recettore Slc7a1.</li>
	<li>(Facoltativo) È possibile utilizzare la blasticidina per selezionare le cellule transdotte stabilmente che esprimono Slc7a1, se desiderato. Dovrebbe essere generata in anticipo una curva di morte con blasticidina per determinare la concentrazione efficace più bassa, generalmente compresa tra 2 e 10 μg/ml, che uccida tutte le cellule bersaglio non transdotte entro 7 giorni. Circa 2 giorni dopo la rimozione del virus Slc7a1, passare le cellule transdotte a un mezzo contenente blasticidina. Coltivare le cellule in mezzo contenente blasticidina per 7 giorni, al termine dei quali tutte le cellule rimanenti esprimeranno stabilmente il recettore del retrovirus e potranno quindi essere transdotte con virus ecotropo, oltre a essere conservate per utilizzi futuri come linea stabile esprimente Slc7a1.</li>
</ol>
3. Titolazione del complesso polimerico per determinare la tossicità
<ol>
	<li>Giorno 1. Seminare le cellule a 5000 cellule/pozzetto in una piastra a 96 pozzetti, prevedendo almeno tre pozzetti replicati per ogni gruppo sperimentale. Includere cellule non transdotte in mezzo completo per fornire un valore di base per cellule sane, nonché campioni costituiti da cellule in mezzo privo di siero per indurre l'arresto della crescita come controllo. Parallelamente, seminare le cellule in un formato appropriato (ad esempio una piastra a 24 pozzetti) per l'analisi microscopica o mediante FACS dell'efficienza di transduzione in ciascuna condizione sperimentale.</li>
	<li>Giorno 2. Transdurre le cellule nelle piastre preparate sia per l'analisi MTT che per quella mediante FACS con un virus codificante per GFP, a un MOI di 0,5 per transdurre circa il 40% delle cellule bersaglio. Testare diverse concentrazioni di CS/PB (ad esempio 50, 100, 200, 400, 600 e 800 mg/ml di ciascun componente), nonché 6 μg/ml di PB, per determinare le quantità ottimali. Generare i complessi polimerici come descritto nella Parte 4 riportata di seguito.</li>
	<li>Giorno 3. Rimuovere il mezzo contenente il virus e sostituirlo con mezzo fresco. Reintrodurre le piastre in un incubatore umidificato.</li>
	<li>Giorno 5. Analizzare la piastra mediante FACS per determinare l'efficienza di transduzione con ciascuna concentrazione polimerica.</li>
	<li>Giorno 6. Rimuovere il mezzo da tutti i pozzetti della piastra MTT e sostituirlo con 100 μl di soluzione MTT (1 mg/ml di MTT in mezzo completo). Incubare per tre ore in un incubatore umidificato per consentire la riduzione del MTT nei mitocondri delle cellule metabolicamente attive.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione MTT e sostituirla con 200 ml di solvente per MTT (0,1 N HCl, 0,1% Igepal CA-630 in isopropanolo).</li>
	<li>Incubare per due ore a temperatura ambiente o fino a quando tutto il precipitato viola di formazano MTT è completamente disciolto. Leggere l'assorbanza con un lettore per micropiastre a 570 nm, sottraendo il valore di fondo rilevato a 690 nm.</li>
	<li>Selezionare la concentrazione ottimale di polimero che determina il massimo incremento della transduzione, come stabilito mediante FACS, con effetto minimo sull'attività metabolica, come determinato mediante MTT. Per le HDF, abbiamo selezionato 100 μg/ml di CS/PB in base ai dati mostrati nei Risultati Rappresentativi riportati di seguito.</li>
</ol>
4. Trasduzione ecotropa con complessazione polimerica
<ol>
	<li>Preparare soluzioni stock di PB e solfato di condroitina, filtrate in modo sterile, a 20 mg/ml in acqua. Aliquotare e conservare a -20°C.</li>
	<li>Trasferire il supernatante virale in una provetta da microcentrifuga e diluirlo alla concentrazione finale desiderata (ad esempio MOI di 2) con mezzo di coltura fresco. Aggiungere successivamente volumi uguali di PB e solfato di condroitina (concentrazioni determinate al punto 3 sopra), agitando leggermente la provetta dopo ogni aggiunta per favorire il mescolamento. La miscela virale diventerà immediatamente torbida con la formazione di precipitati. Incubare la miscela virale a temperatura ambiente per 5 minuti per consentire la formazione dei complessi.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo dalle cellule bersaglio che esprimono il recettore, sostituirlo con la miscela virale e incubare tutta la notte a 37°C, 5% CO2. Dopo aver rimosso la miscela virale, lavare la superficie delle cellule due volte con PBS per facilitare l'eliminazione dei complessi virali. Non è necessaria una rimozione completa; non abbiamo osservato effetti avversi sulla vitalità cellulare dovuti alla presenza di complessi polimerici residui.</li>
</ol>
5. Verifica della specificità della trasduzione ecotropica
<ol>
	<li>Quando si produce per la prima volta un virus ecotropico, è prudente, per motivi di sicurezza, verificare che il virus non sia in grado di trasdurre cellule umane non modificate. Trasdurre le cellule umane con lentivirus ecotropico a concentrazione relativamente elevata (solo un’1-2 volte diluizione del supernatante virale nel mezzo fresco) durante la notte con 6 μg/ml PB o con la concentrazione ottimizzata di CS/PB.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo contenente il virus e sostituirlo con mezzo fresco. Dopo aver incubato le cellule per 2 giorni, verificare l’espressione del transgene mediante FACS utilizzando vettori fluorescenti e/o mediante RT-PCR con primer specifici per il transgene.</li>
</ol>
6. Risultati rappresentativi:
La Figura 1A mostra il processo di produzione del lentivirus, e la Figura 1B illustra la trasduzione di cellule umane con lentivirus ecotropico, inclusa la pre-trasduzione con il recettore del retrovirus murino Slc7a1. Per la titolazione del virus, utilizziamo una linea cellulare di rabdomiosarcoma umano stabilmente trasdotta con Slc7a1 (Slc-hRMS). Quando si utilizzano vettori di controllo fluorescenti per monitorare l'efficienza di trasduzione, otteniamo regolarmente &gt; Efficienza di trasduzione del 90% di Slc-hRMS con virus ecotropico, come mostrato nelle Figure 2A e 2B. I tassi di trasduzione dei HDF sono generalmente più bassi poiché le cellule non sono state selezionate con blasticidina per l'espressione del recettore (Figura 2C). I titoli del lentivirus ecotropico sono generalmente il 10-20% di quelli del virus pseudotipizzato con VSV quando misurati su Slc-hRMS (Figura 2D).
Un ciclo di congelamento-scongelamento riduce il titolo del virus ecotropo del 16 - 3%, pari alla perdita di titolo osservata durante un singolo ciclo di congelamento-scongelamento del virus pseudotipizzato con VSV (p &gt; 0,05). Contrariamente a quanto riportato in precedenti studi,2 non osserviamo alcun effetto positivo sul titolo virale dovuto al congelamento rapido in ghiaccio secco. Al contrario, otteniamo titoli post-scongelamento più elevati per entrambi i pseudotipi semplicemente posizionando le provette del virus in un congelatore a -80°C (dati non mostrati).
Il saggio di vitalità MTT consente una rilevazione sensibile dell'arresto della crescita nelle cellule bersaglio. La trasduzione con il virus più concentrazioni di CS/PB fino a 800 μg/ml non ha alcun effetto sul metabolismo dei fibroblasti dermici umani (HDF) (Fig. 3A). L'esposizione a CS/PB senza virus non ha neppure alcun effetto tossico sulle cellule (dati non mostrati). L'analisi FACS degli HDF trasdotti con il virus e diverse concentrazioni di CS/PB mostra un potenziamento della trasduzione rispetto al PB da solo (Fig. 3B). Il massimo potenziamento si verifica a 100 μg/ml di CS/PB (Fig. 3C), di un valore inferiore di diversi ordini di grandezza rispetto ai valori precedentemente riportati.3 Pertanto, è importante ottimizzare le condizioni per ogni specifico tipo cellulare bersaglio.
La complessazione con CS/PB aumenta di circa 3 volte il titolo osservato in Slc-hRMS (Fig. 4A, p &lt; 0,01). In pratica, questo determina un effetto maggiore sull'efficienza di trasduzione a basse concentrazioni di virus rispetto a concentrazioni più elevate (Fig. 4B), il che è molto probabilmente dovuto a cellule trasdotte in modo multiplo e alla saturazione dei recettori a concentrazioni elevate di virus.
La trasduzione con virus ecotropico è specifica per le cellule che esprimono il recettore per retrovirus murino. Quando si effettua la trasduzione di cellule umane non modificate con virus ecotropico, non abbiamo osservato fluorescenza superiore al fondo delle cellule non trasdotte, sia utilizzando PB che CS/PB, come mostrato nella Figura 5A. Microscopicamente, le HDF non mostrano alcuna trasduzione in assenza del recettore (Figura 5B), mentre la pre-trasduzione con il recettore determina la comparsa di cellule fluorescenti (Figura 5C).
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig1.jpg" alt="Diagramma del processo di produzione di lentivirus, che illustra la trasduzione di cellule 293T e le fasi del supernatante virale." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1. Vista schematica di (A) il processo di produzione del virus e di (B) la trasduzione di cellule umane con recettore retrovirale murino seguita da lentivirus ecotropico.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig2.jpg" alt="Grafici di citometria a flusso, analisi della percentuale di cellule GFP+, microscopia a fluorescenza, istogramma della titolazione del virus." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Trasduzione ad alta efficienza di cellule umane con lentivirus ecotropico che codifica per GFP. Le cellule sono state pre-trasdotte con il recettore per retrovirus murino Slc7a1. (A) Linea cellulare di rabdomiosarcoma umano selezionata con blasticidina per Slc7a1 (Slc-hRMS), trasdotta (blu) o non trasdotta (rosa) con GFP. (B) Microfotografia in fluorescenza di Slc-hRMS trasdotte con virus ecotropico (4X). (C) HDF trasdotte (blu) e non trasdotte (rosa) con lentivirus ecotropico GFP; le cellule sono state trasdotte con Slc7a1 due giorni prima della trasduzione ecotropica. (D) Titolo del lentivirus pseudotipizzato con VSV-G e del lentivirus ecotropico, misurato su Slc-hRMS.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig3.jpg" alt="Effetti della concentrazione del polimero sull'espressione di GFP; grafici di assorbanza, citometria a flusso e percentuale di GFP." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Ottimizzazione delle concentrazioni di condroitina solfato/polibrene (CS/PB) in fibroblasti dermici umani. (A) Vitalità dei fibroblasti dermici umani misurata mediante saggio MTT dopo la trasduzione in presenza di PB soltanto o con diverse concentrazioni di CS/PB. (B) Miglioramento dell'efficienza di trasduzione nei fibroblasti dermici umani ottenuto con diverse concentrazioni di CS/PB, misurato mediante FACS. (C) Quantificazione del miglioramento della trasduzione, che mostra come la trasduzione massima si verifichi a 100 μg/ml di CS/PB.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig4.jpg" alt="Efficienza di trasduzione genica rispetto all'analisi del titolo, grafico a barre e diagramma a dispersione, confronto dell'effetto della polibrena." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figura 4"> 
Figura 4. Effetto di 400 μg/ml di CS/PB sulla trasduzione di Slc-hRMS con lentivirus ecotropico. (A) Aumento del titolo e (B) variazione del tasso di trasduzione rispetto a 6 μg/ml di polibrena da sola.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig5.jpg" alt="Grafico dell'intensità della GFP in citometria a flusso con immagini di microscopia a fluorescenza che mostrano la distribuzione delle cellule GFP+" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figura 5"> 
Figura 5. Assenza di trasduzione ecotropica dei fibroblasti dermici umani (HDF) in assenza del recettore del retrovirus murino Slc7a1. (A) Diagramma FACS di fibroblasti umani BJ, non trasdotti (rosa) o trasdotti (blu) con lentivirus GFP ecotropico, in entrambi i casi in assenza del recettore Slc7a1. Fibroblasti umani BJ trasdotti con lentivirus GFP ecotropico, senza (B) e con (C) pre-trasduzione con il recettore Slc7a1 (4X).

<ol><li>Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charged+polymers+modulate+retrovirus+transduction+via+membrane+charge+neutralization+and+virus+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation.</a> Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).</li>
<li>Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-+to+large-scale+production+of+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Small- to large-scale production of lentivirus vectors.</a> Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).</li>
<li>Landazuri, N., LeDoux, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+of+retroviruses+with+charged+polymers+enhances+gene+transfer+by+increasing+the+rate+that+viruses+are+delivered+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Complexation of retroviruses with charged polymers enhances gene transfer by increasing the rate that viruses are delivered to cells.</a> J Gene Med. 6, 1304-1319 (2004).</li>
<li>Ohnuki, M., Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 4, 4A.2-4A.2 (2009).</li>
<li>Hotta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EOS+lentiviral+vector+selection+system+for+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">EOS lentiviral vector selection system for human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 4, 1828-1844 (2009).</li>
<li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+nondividing+cells+using+pseudotyped+defective+high-titer+HIV+type+1+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 15266-15271 (1996).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+to+the+center+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Journey to the center of the cell.</a> Cell. 105, 697-700 (2001).</li>
<li>Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+the+tropism+of+lentiviral+vectors+through+pseudotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping.</a> Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).</li>
<li>Schambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+pseudotyped+with+murine+ecotropic+envelope%3A+increased+biosafety+and+convenience+in+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors pseudotyped with murine ecotropic envelope: increased biosafety and convenience in preclinical research.</a> Exp Hematol. 34, 588-592 (2006).</li>
<li>Koch, P., Siemen, H., Biegler, A., Itskovitz-Eldor, J., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+human+embryonic+stem+cells+by+ecotropic+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transduction of human embryonic stem cells by ecotropic retroviral vectors.</a> Nucleic Acids Res. 34, e120-e120 (2006).</li>
<li>Yoshimoto, T., Yoshimoto, E., Meruelo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+characterization+of+a+novel+human+gene+homologous+to+the+murine+ecotropic+retroviral+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and characterization of a novel human gene homologous to the murine ecotropic retroviral receptor.</a> Virology. 185, 10-17 (1991).</li>
<li>Cepko, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+preparation+and+concentration+of+retrovirus+stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Large-scale preparation and concentration of retrovirus stocks.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.12-Unit 9.12 (2001).</li>
<li>Doux, J. M. L. e, Landazuri, N., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+of+retrovirus+with+cationic+and+anionic+polymers+increases+the+efficiency+of+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer.</a> Hum Gene Ther. 12, 1611-1621 (2001).</li>
<li>Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> J Virol. 72, 9873-9880 (1998).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ricombinante gammaretrovirus ecotropic basato sul virus della leucemia murina Moloney (MLV) e il suo recettore mSlc7a1 sono ben studiati e ampiamente disponibili, siano stati utilizzati per oltre 20 anni per fornire transgeni alle cellule murine. Gammaretrovirus Ecotropic è stato usato più di recente per fornire oncogeni alle cellule umane;. Nell&#39;ambito della riprogrammazione cellulare, l&#39;uso di mSlc7a1 per evitare la generazione di virus oncogeni amphotropic ospitare umano è ben consolidata 4,5 Tuttavia, lentivirus offre vantaggi significativi rispetto gammaretrovirus nella trasduzione popolazioni di cellule refrattario, compresi 6 celle primarie, che sono spesso obiettivi auspicabili per la riprogrammazione, in quanto il lentivirale pre-integrazione di trasduzione del complesso permette di non dividere le celle 7. Lentivirus sono state prodotte con decine di pseudotypes diversi, tra cui MLV, nel tentativo di alterare tropismo del virus, la tossicità, e altre proprietà. 8 MLV-pseudotyped lentivirus ecotropic è stato utilizzato per trasdurre cellule di topo, 9 ma raramente è stato utilizzato su cellule umane 10. Proponiamo quindi l&#39;uso di MLV-pseudotyped lentivirus ecotropic come un veicolo sicuro, conveniente e altamente efficiente per fornire oncogeni noti o sospetti, tra cui i fattori di riprogrammazione cellulare, alle cellule umane. È fondamentale notare che questo protocollo non del tutto elimina la necessità di produrre e utilizzare lentivirus pantropic, anzi, questo protocollo separa l&#39;oncogene (s) dal virus pantropic, isolante ricercatori potenziale di auto-inoculazione con cancro-correlata virus. Il mSlc7a1 proteina e il suo omologo umano hSlc7a1 sono espresse ubiquitariamente trasportatori di aminoacidi senza tumorigenicità note o la capacità di conferire un vantaggio selettivo di crescita su cellule riceventi, 11 mSlc7a1 realizzazione di rischio relativamente basso per incorporazione in amphotropic virus. Questo passo ha aggiunto può essere particolarmente utile nei laboratori privi di virus o strutture dedicate coltura dei tessuti del livello richiesto biosicurezza. In alcune situazioni può essere possibile eliminare completamente l&#39;uso di virus pantropic dalla trasfezione del plasmide Slc7a1 direttamente nelle cellule bersaglio, tuttavia, molte cellule che sarebbe utile obiettivi di questa tecnica sono refrattari alla trasfezione. In alternativa, la capacità di isolare Slc7a1-trasdotte dalla selezione blasticidin significa che VSV-G lentivirus pseudotyped può essere utilizzato una sola volta per generare uno stock di cellule che esprimono recettori, dopo di che virus ecotropic può essere utilizzato di routine per trasdurre queste cellule per molti esperimenti. I ricercatori dovrebbero sempre seguire le loro linee guida di sicurezza istituzionali per lavorare con qualsiasi lentivirus, indipendentemente dal suo tropismo. I titoli del virus ecotropic ottenuti con questo protocollo sono moderatamente inferiori VSV-pseudotyped virus, in genere il 10-20% del titolo virus pantropic, in accordo con precedenti studi. 9 Questi titoli sono stati misurati in cellule umane trasdotte stabilmente con Slc7a1, in modo che il minore titolo osservato per ecotropic virus può essere in parte a causa di variegata espressione del gene del recettore nelle cellule bersaglio. Tuttavia, la titoli virale raggiunto nel nostro protocollo sono più che sufficienti per la maggior parte delle applicazioni e portare alla trasduzione della maggior parte delle cellule, in alcuni casi&gt; 90% delle cellule. Centrifugazione basati su tecniche sono comunemente utilizzati per concentrare le particelle virali. Tuttavia, centrifugazione richiede diverse ore, genera aerosol infettivi, e può causare una perdita significativa di particelle virali. 12 In alternativa, la complessazione con CS / PB può essere usato per migliorare la trasduzione senza alterare tropismo virale. 3 Questo metodo è rapido (5 minuti ) e poco costoso (0,03 dollari per 10 ml di virus), mentre circa triplicando il titolo osservato. Non occorrono attrezzature o reagenti proprietari sono tenuti, e abbiamo osservato minima tossicità acuta dopo l&#39;esposizione di HDFS di CS / PB, in accordo con precedenti lavori in altre linee cellulari. 13 Un potenziale svantaggio di questo protocollo è che alcuni complessi microscopicamente visibili polimero aderire le cellule per diversi giorni in coltura. Non possiamo escludere la possibilità che questi complessi, anche se non apertamente tossico per le cellule, possono avere effetti più sottili sui processi cellulari. Qui abbiamo descritto una metodologia per la sicura ed efficiente trasduzione cellule umane con fattori oncogenici. Questo approccio dovrebbe essere di grande utilità per i ricercatori che studiano oncogeni e biologia delle cellule staminali comprese le cellule iPS.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> pLenti6/UbC/mSlc7a1 </td><td> Addgene </td><td> 17224 </td><td> MLV recettore murino </td></tr><tr><td> pMD2.G </td><td> Addgene </td><td> 12259 </td><td> VSV-G busta </td></tr><tr><td> pCMV-dR8.91 </td><td> D. Trono di laboratorio 14 </td><td></td><td> Packaging plasmide (equivalente psPax2 plasmide è disponibile presso Addgene, cat. Numero 12260) </td></tr><tr><td> pHCMV-EcoEnv </td><td> Addgene </td><td> 15802 </td><td> Busta Ecotropic </td></tr><tr><td> FUGW </td><td> Addgene </td><td> 14883 </td><td> GFP plasmide di controllo </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche </td><td> 04 709 705 001 </td><td></td></tr><tr><td> Hexadimethrine bromuro (polibrene) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9268 </td><td></td></tr><tr><td> Condroitin solfato di sodio sale da cartilagine di squalo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4384 </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Pescatore </td><td> BP 2647100 </td><td></td></tr><tr><td> Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio bromuro (MTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2128 </td><td></td></tr><tr><td> Igepal CA-630 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I3021 </td><td></td></tr></tbody></table>

trasduzione di cellule umane con polymer-complessato lentivirus ecotropic per enhanced biosicurezza

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Staminali tumorali e studi di biologia cellulare spesso richiedono trasduzione virale delle cellule umane con oncogeni noti o sospetti, sollevando problemi di sicurezza maggiori per il personale di laboratorio. Lentivirus Pantropic, come comunemente utilizzati VSV-G pseudotype, sono uno strumento prezioso per studiare la funzione del gene perché possono trasdurre molti tipi di cellule, comprese le cellule non si dividono. Tuttavia, i ricercatori potrebbero voler evitare la produzione e la centrifugazione di virus oncogeni pantropic codifica per esigenze di più alto livello la gestione di biosicurezza e le questioni di sicurezza. Diversi oncogeni potenti, tra cui c-Myc e SV40 T antigene di grandi dimensioni, sono noti per aumentare la produzione di cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC). Tutti gli altri noti cambiamenti genetici che inducono IPSC (Oct4, Sox2, Klf4, Nanog, LIN28, e la perdita della funzione di p53) hanno anche i link al cancro, che li rende di preoccupazione per la sicurezza relativamente elevata. Anche se questi tumori correlati virus sono utili per studiare la riprogrammazione cellulare e pluripotenza, devono essere usati in modo sicuro. Per affrontare questi problemi di biosicurezza, abbiamo dimostrato un metodo per la trasduzione di cellule umane con lentivirus ecotropic, con enfasi sulla riduzione dei costi e gestione conveniente. Abbiamo prodotto lentivirus ecotropic con titolo sufficientemente elevato per trasdurre superiore al 90% del esprimono i recettori delle cellule umane esposte al virus, convalidando l&#39;efficacia di questo approccio. Lentivirus è spesso concentrata per ultracentrifugazione, tuttavia, questo processo richiede diverse ore e può produrre aerosol infettivi a uomo ricercatori biomedici. In alternativa, le particelle virali possono essere più sicuro sedimentano sulla cellule per complessazione con solfato di condroitina e polibrene (CS / PB). Questa tecnica aumenta il titolo funzionale virale fino a 3 volte nelle cellule che esprimono stabilmente recettore retrovirus murino, con trascurabili tempo aggiunto e costo. Trasduzione di fibroblasti cutanei umani (HDFS) è al massimo migliorata utilizzando CS / PB concentrazioni di circa 4 volte inferiore al valore ottimale riportato in precedenza per le linee di cellule tumorali, suggerendo che la concentrazione polimero deve essere titolato per il tipo di destinazione delle cellule di interesse. Abbiamo quindi descritto l&#39;uso di methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio bromuro (MTT) al dosaggio per la tossicità dei polimeri in un nuovo tipo di cellula. Osserviamo vitalità equivalente di HDFS dopo trasduzione virale utilizzando complessazione polimero o la dose standard di polibrene (PB, 6 mg / ml), con l&#39;indicazione minima tossicità acuta. In questo protocollo, si descrive l&#39;utilizzo di lentivirus ecotropic per la sovraespressione di oncogeni nelle cellule umane, riducendo i rischi di biosicurezza e l&#39;aumento del tasso di trasduzione. Abbiamo anche dimostrare l&#39;uso di complessazione polimero per migliorare la trasduzione, evitando di aerosol centrifugazione formazione di particelle virali.

Lentivirus sono un valido strumento di ricerca per esplorare la funzione del gene, tuttavia, i ricercatori potrebbero voler evitare la produzione di codifica lentivirus pantropic oncogeni noti o sospetti. In alternativa, vi presentiamo un protocollo più sicuro per l&#39;utilizzo del lentivirus ecotropic su cellule umane modificate per esprimere la mSlc7a1 ecotropic recettore.

Trasduzione di cellule umane con Polymer-complessato Lentivirus Ecotropic per Enhanced biosicurezza

Gli studi sulla biologia delle cellule staminali e tumorali richiedono spesso la trasduzione virale di cellule umane con oncogeni noti o sospetti, sollevando importanti questioni di sicurezza per...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è introdurre oncogeni o altri geni potenzialmente pericolosi in cellule umane mediante lentivirus ecotropici. Ciò si ottiene producendo un lentivirus pantropico, che codifica per il recettore del retrovirus murino, insieme a un lentivirus ecotropico che codifica per il gene d'interesse. Le cellule vengono quindi trasdotte con il recettore del retrovirus murino, rendendole suscettibili alla trasduzione con il virus ecotropico. Successivamente, le cellule vengono trasdotte con il virus ecotropico al fine di introdurre l'oncogene, utilizzando la complessazione polimerica con polibrene e solfato di condroitina per potenziare la trasduzione. I risultati ottenuti mostrano una trasduzione selettiva delle cellule umane con lentivirus tropici, basata su microscopia fluorescente e analisi FACS.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la trasduzione con retrovirus gamma, è che le particelle lentivirali possono trasdurre in modo più efficace molti tipi cellulari, inclusi le cellule non proliferanti come le cellule staminali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sul cancro e sulle cellule staminali, ad esempio comprendere la funzione di potenziali oncogeni. Prima di iniziare questa procedura, consultare l'addetto alla sicurezza della propria istituzione e seguire le linee guida sulla sicurezza da questi raccomandate.Iniziare con una coltura di cellule 293T sane e in rapida crescita, lavorando in una cappa a flusso laminare. In condizioni asettiche, risospendere 5 × 10⁶ cellule 293T in 10 millilitri di mezzo per cellule 293T senza antibiotici. Pipettare la sospensione cellulare in una piastra per colture tessutali da 10 centimetri e incubare la piastra durante la notte in un incubatore per colture cellulari a 37 °C e 5% di anidride carbonica.Il giorno successivo, iniziare la trasfezione nel tardo pomeriggio. Per prima cosa, prelevare un'aliquote di Optum e dei plasmidi di trasferimento, confezionamento ed envelope, e lasciarli riscaldare a temperatura ambiente. Pipettare 375 microlitri di Optum in una provetta da microcentrifuga, quindi aggiungere 25 microlitri di reagente di trasfezione FU gene HD. Assicurarsi che il reagente FU gene venga pipettato direttamente nel mezzo e non entri in contatto con le pareti della provetta.Successivamente, in un secondo tubo da microcentrifuga, unire cinque microgrammi del plasmide di trasferimento, 3,75 microgrammi del plasmide di impacchettamento e 1,25 microgrammi del plasmide dell'involucro nella quantità necessaria di OptiMEM per portare il volume a 100 microlitri. Quindi aggiungere la miscela OptiMEM al tubo contenente la miscela di plasmidi e incubare a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Durante gli ultimi minuti dell'incubazione, aspirare molto delicatamente il mezzo dalla piastra contenente le cellule 293T e sostituirlo con 10 millilitri di mezzo fresco per cellule 293T privo di antibiotici.Infine, aggiungere a gocce il mix di plasmidi del gene FU nel mezzo della piastra da 10 centimetri. Posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e incubare per tutta la notte. Il giorno successivo, aspirare molto delicatamente il mezzo dalla piastra e sostituirlo con mezzo 2 9 3 T fresco privo di antibiotici.Quindi reinserire la piastra nell'incubatore per colture cellulari e incubare per altri due giorni. A tre giorni dalla trasfezione, aspirare il mezzo contenente il virus dalla piastra e filtrarlo utilizzando un filtro con bassa capacità di legame proteico da 0,45 micron. Dopo il filtraggio, concentrare il virus; effettuare diluizioni seriali di un virus controllo fluorescente in mezzo fresco privo di antibiotici contenente sei microgrammi per millilitro di polibrene e utilizzare queste diluizioni per trasdurre le cellule della linea cellulare appropriata. Il giorno successivo, in una piastra a 24 pozzetti, sostituire il mezzo con mezzo fresco privo di antibiotici, quindi proseguire l'incubazione per altri due giorni per consentire alle cellule di esprimere la proteina fluorescente.Utilizzare i dati ottenuti per determinare la frazione di cellule transdotte per ogni diluizione virale. Calcolare quindi il titolo in unità trasformanti per millilitro in base alle diluizioni che producono una transduzione inferiore al 15%, al fine di minimizzare gli eventi di transduzione multipla. Si presume che il titolo di altri lentivirus non fluorescenti prodotti in parallelo sia simile a quello del virus fluorescente.Per trasdurre le cellule bersaglio, iniziare selezionando una molteplicità di infezione maggiore di due per garantire che la maggior parte delle cellule venga trasdotta. Diluire prima il supernatante virale alla molteplicità di infezione richiesta in mezzo di coltura completo fresco, aggiungendo sei microgrammi per millilitro di polibrene fino a un volume finale di un millilitro.Aspirare il mezzo da una piastra di 35 millimetri contenente le cellule bersaglio e aggiungere un millilitro di surnatante virale diluito. Incubare nell'incubatrice per colture cellulari per 24-48 ore per consentire un'espressione sufficiente del recettore SLC seven A one, se desiderato. Utilizzare la selezione antibiotica con blaster sein per selezionare le cellule transdotte stabilmente che esprimono SLC seven A one, seguendo le istruzioni riportate nella procedura scritta.Per iniziare la determinazione della tossicità, preparare una soluzione madre di 20 milligrammi per millilitro di solfato di condroitina e una soluzione madre di 20 milligrammi per millilitro di poly brain in acqua, quindi filtrare in modo sterile. Le soluzioni madri in eccesso possono essere conservate a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso.Successivamente, determinare il numero di colture cellulari in piastre a 96 pozzetti necessarie per valutare con precisione la tossicità del complesso polimerico. Mediante il saggio MTT, almeno sei concentrazioni di solfato di condroitina e poli verde devono essere testate in triplice replicato. Inoltre, includere cellule non trattate e cellule coltivate in assenza di siero.Occorre includere un mezzo di controllo per fornire una linea di base per cellule sane e per controllare rispettivamente l'arresto della crescita. Una volta determinato il numero di pozzetti necessari, seminare 5.000 cellule bersaglio in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, seminando parallelamente le cellule in una piastra a 24 pozzetti per l'analisi microscopica o basata su dati dell'efficienza di trasduzione in ciascuna condizione sperimentale; lasciare crescere entrambi i gruppi di cellule per tutta la notte. Il giorno successivo, prelevare un'aliquote della soluzione stock di solfato di condroitina e un'aliquote della soluzione stock di polibrene.Quindi diluire il virus che codifica per GFP in un mezzo privo di antibiotici contenente sei microgrammi per millilitro di polibrene, a una multiplicità di infezione sufficiente a trasdurre circa il 10-50% delle cellule bersaglio per pozzetto. Assicurarsi che vi sia abbastanza virus diluito per ciascuna condizione di prova più i pozzetti di controllo su ogni piastra. Etichettare un insieme di provette con ciascuna concentrazione di solfato di condroitina e polimero poliverde da testare.Quindi aliquotare una quantità sufficiente della sospensione virale per ciascuna condizione, in triplice replicato, nei tubi. Successivamente, pipettare il volume richiesto di soluzione madre di solfato di condroitina e poli-brain per ottenere le concentrazioni di prova in ciascuno dei tubi in successione. Immediatamente dopo l'aggiunta di solfato di condroitina e poli-green, agitare brevemente il tubo per mescolare.Lasciare incubare le miscele di virus, condroitin solfato e verde poli a temperatura ambiente per cinque minuti. La miscela può diventare torbida con la formazione di precipitati virali. Al termine dell'incubazione, aspirare il mezzo dalle pozzette della piastra a 96 pozzette.Quindi aggiungere la miscela di virus, condroitin solfato e poli verde alle pozzette come previsto. Pipettare anche il controllo e il mezzo privo di siero nelle pozzette appropriate. Ripetere il procedimento per la piastra a 24 pozzette e incubare tutta la notte nell'incubatore per colture cellulari.Successivamente, aspirare il mezzo contenente il virus dalle piastre e sostituirlo con mezzo fresco. Rimettere le piastre nell'incubatore per 48 ore. Dopo 48 ore, rimuovere la piastra a 24 pozzetti e utilizzare i dati per analizzare l'efficienza di trasduzione di ciascuna concentrazione di solfato di condroitina e poli-cervello.Il giorno seguente. Aspirare il mezzo da tutti i pozzetti della piastra a 96 pozzetti e sostituirlo con 100 microlitri di soluzione di MTT per tre ore in un incubatore umidificato, in modo che il MTT venga ridotto nei mitocondri delle cellule metabolicamente attive. Dopo tre ore, aspirare la soluzione di MTT e sostituirla con 200 microlitri di soluzione solvente.Incubare la piastra per due ore a temperatura ambiente o fino a quando tutto il formazionepurpura di MTT e il precipitato si saranno sciolti. Leggere l'assorbanza con un lettore per micropiastre a 570 nanometri, sottraendo la lettura di fondo a 690 nanometri. La concentrazione ottimale del polimero produrrà un massimo miglioramento della trasduzione, determinato da dati sperimentali, con effetto minimo sull'attività metabolica, determinato tramite MTT per hdfs.100 microgrammi per millilitro di solfato di condroitina. Poly brain è la concentrazione ottimale del polimero determinata mediante questo metodo. Preparare innanzitutto una quantità sufficiente di miscela di solfato di condroitina poli verde virale sup natant a 100 microgrammi per millilitro per trasdurre il numero richiesto di piastre da 35 millimetri di cellule HDF esprimenti il recettore SLC sette A uno. Incubare la miscela per cinque minuti per consentire la formazione dei complessi polimerici.Quindi aspirare il mezzo dalle cellule target che esprimono il recettore e sostituirlo con la miscela virale, incubando tutta la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo aver rimosso la miscela virale, lavare due volte la superficie delle cellule con PBS per facilitare l'eliminazione dei complessi virali. La rimozione completa non è necessaria, poiché non sono stati osservati effetti avversi sulla salute cellulare derivanti da complessi polimerici residui.Questa immagine al microscopio a fluorescenza illustra una trasduzione sufficiente di cellule di sarcoma umano che esprimono stabilmente SLC seven A one con virus tropico, quando si utilizzano vettori di controllo fluorescenti per monitorare l'efficienza di trasduzione. La quantificazione della fluorescenza mediante analisi fax dimostra un'efficienza di trasduzione superiore al 90%. I tassi di trasduzione degli HDFS sono generalmente più bassi perché le cellule non sono state attivate né selezionate per l'espressione del recettore; i titoli di lentivirus atropico sono generalmente del 10-20% rispetto al virus pseudo-tipizzato VSV misurati su S-L-C-H-S-C. Il saggio di vitalità MTT consente una rilevazione sensibile dell'arresto della crescita nelle cellule bersaglio, come osservato in questo caso dopo trasduzione con virus e concentrazioni di solfato di condroitina.Polibraio fino a 800 microgrammi per millilitro non ha alcun effetto sul metabolismo dei HDF. Analisi fax di HDFS transdotti con virus più varie concentrazioni di solfato di condroitina. Poliverde mostra un potenziamento della transduzione rispetto a Poliverde da solo.L'incremento massimo si verifica a 100 microgrammi per millilitro. Il poli-solfato di condroitina del cervello è di diversi ordini di grandezza inferiore ai valori precedentemente riportati. Pertanto, è importante ottimizzare le condizioni per ogni tipo cellulare specifico in merito alla complessazione con il solfato di condroitina.Poly brain aumenta il titolo osservato, circa di tre volte in S-L-C-H-S-C. In pratica, questo produce un effetto maggiore sull'efficienza di trasduzione a basse concentrazioni di virus rispetto a concentrazioni più elevate, il che è molto probabilmente dovuto alla presenza di cellule trasdotte multiple e alla saturazione dei recettori a concentrazioni elevate di virus. La trasduzione con virus tropici è specifica per le cellule che esprimono il recettore per retrovirus neuronali.Quando si trasduce cellule umane non modificate con virus tropici, una fluorescenza superiore al fondo non ridotto non è stata osservata, come evidenziato dall'analisi al microscopio a fluorescenza. Gli HDFS non mostrano alcuna trasduzione in assenza di recettore, mentre la pre-trasduzione con il recettore determina cellule fluorescenti. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di verificare che il virus non trasduca cellule umane modificate.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare lentivirus tropici per trasferire geni potenzialmente pericolosi in cellule umane, inclusa l'uso della complessazione con polimeri per migliorare la trasduzione.

transduction-human-cells-with-polymer-complexed-ecotropic-lentivirus

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Vettori di espressione lentivirali sono i veicoli più efficaci per esprimere stabilmente diverse molecole effettrici o costrutti reporter nel dividere e non la divisione delle cellule di mammiferi e di interi organismi. Qui forniamo un protocollo su come confezionare costrutti di espressione lentivector particelle pseudoviral e di trasdurre cellule bersaglio utilizzando le particelle pseudoviral.

Packaging HIV o FIV-based Lentivector costrutti di espressione e di trasduzione del VSV-G Pseudotyped particelle virali

RNA interference (RNAi) possiede molti vantaggi rispetto knockout del gene ed è stato ampiamente utilizzato come strumento in studi di geni funzionali. L'invenzione di DNA vettoriale basata RNAi tecnologia ha fatto lungo termine e smontabile gene inducibile possibile, e anche aumentata la possibilità di silenziamento...

DNA Vector-based RNA Interference per studiare la funzione del gene in Cancro

Descriviamo un metodo per modificare geneticamente primarie cellule T umane con un transgene utilizzando il non...

piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

Qui, usiamo trasduzione retrovirale e trasfezione concatemeric per creare una linea cellulare che può esprimere le componenti di un vettore lentivirale (LV) in assenza di tetraciclina. Questo LV codifica GFP ed è pseudotyped con una glicoproteina, SVGmu, che è specifico per un recettore sulle cellule dendritiche.

Una linea cellulare tetraciclina regolata produce vettori lentivirali ad alto titolo che si rivolgono specificamente cellule dendritiche

Le cellule epiteliali bronchiali umane primarie sono difficili da trasdurre. Questo protocollo descrive la produzione di lentivirus e la loro concentrazione, nonché le condizioni di coltura ottimali necessarie per ottenere trasduzioni altamente efficienti in queste cellule durante la differenziazione in un epitelio pseudostratificato.

Ottimale Lentivirus di produzione e colture cellulari condizioni necessarie al successo le cellule trasdurre primario dell&#39;uomo epiteliali bronchiali

Questo protocollo descrive un metodo per realizzare l'integrazione stabile di un gene di interesse nel genoma umano di sistema Sleeping Beauty trascrizionalmente regolato. Preparazione dell'integrazione dei vettori lentivirali difettosi, la trasduzione in vitro di cellule umane e l'analisi molecolare sulle cellule trasdotte sono segnalati.

Un metodo efficiente In Vitro trasposizione da un sistema di bellezza dormire trascrizionalmente regolata confezionato in un vettore lentivirale difettoso di integrazione

Qui, presentiamo un protocollo per la modulazione dell'espressione del transgene utilizzando pEUI(+) singolare gene interruttore di tebufenozide trattamento.

Un ecdisone basati su recettori di interruttore di singolare Gene per deliberata espressione del Transgene con robustezza, reversibilità e permeabilità trascurabile

Utilizzando il polimero cationico a basso costo polietilenimina (PEI), abbiamo prodotto particelle lentivirali per l'espressione stabile di shRNA in cellule staminali embrionali umane H9 (hESC) e cellule progenitrici neurali derivate da H9 trasdotte transitoriamente (NPC) ad alta efficienza.

Consegna mediata lentivirale di shRNA a hESC e NPC utilizzando polietilenimina polimerica cationica a basso costo (PEI)

Questo protocollo descrive la riprogrammazione in vivo di cellule tumorali di topo in cellule dendritiche di tipo 1 all'interno del microambiente tumorale attraverso l'espressione forzata dei fattori di trascrizione PU.1, IRF8 e BATF3.

Riprogrammazione trattabile in vivo di cellule tumorali in cellule dendritiche convenzionali di tipo 1

Qui descriviamo un metodo per la visualizzazione basata su cellule, la localizzazione subcellulare e l'analisi quantitativa di focali arricchiti di poli(ADP-ribosio) (PAR) in cellule mammiferiche fissate. Questo saggio consente la quantificazione dei siti di attivazione del PARP indotta dal danno del DNA, inclusi quelli associati alla riparazione da escissione delle basi o alla riparazione della rottura a filamento singolo, nei nuclei delle cellule esposte alla genotossina.

Visualizzazione e analisi quantitativa dell'attivazione di PARP1/PARP2 indotta da genotossine nelle cellule utilizzando un Reporter a base di proteine a fusione fluorescente

Scopri la trasduzione di cellule umane con lentivirus ecotropo e complessazione polimerica per introdurre oncogeni in sicurezza. Questo metodo migliora l'efficienza e riduce i rischi rispetto ai lentivirus pantropi.

Trasduzione di cellule umane con Polymer-complessato Lentivirus Ecotropic per Enhanced biosicurezza

Esplora altri video