Trasduzione di cellule umane con Polymer-complessato Lentivirus Ecotropic per Enhanced biosicurezza

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di introdurre oncogeni o altri geni potenzialmente pericolosi nelle cellule umane utilizzando l'echo tropic lentivirus. Ciò si ottiene producendo lentivirus pantropico, che codifica per il recettore del retrovirus del topo, così come il lentivirus ecotropico che codifica per il gene di interesse, le cellule vengono trasdotte con il recettore del retrovirus del topo, il che le rende suscettibili alla trasduzione con il virus ecotropico. Successivamente, le cellule vengono trasdotte con il virus eco tropico al fine di introdurre l'oncogene utilizzando la complessazione polimerica con poli cervello e condroitina solfato per migliorare la trasduzione, si ottengono risultati che mostrano la trasduzione selettiva di cellule umane con lentivirus tropicale sulla base della microscopia a fluorescenza e dei fatti.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la trasduzione retrovirale gamma, è che le particelle lentivirali possono trasdurre più efficacemente molti tipi di cellule, comprese le cellule non in divisione come le cellule staminali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul cancro e sulle cellule staminali, come la comprensione della funzione di potenziali oncogeni. Prima di iniziare questa procedura, consulta il tuo funzionario per la sicurezza istituzionale e segui le linee guida di sicurezza consigliate.

Iniziare con una coltura di cellule T sane 2 9 3 in rapida crescita che lavorano in una cappa di coltura tissutale. In condizioni asettiche, sospendere cinque volte 10 delle 6 2 9 3 cellule T in 10 millilitri di terreno 2 9 3 T privo di antibiotici. Pipettare la sospensione cellulare in una piastra di coltura tissutale di 10 centimetri e incubare la piastra per una notte in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Il giorno successivo, inizia la trasfezione nel tardo pomeriggio. Per prima cosa, raccogliere un'aliquota di Optum e la confezione di trasferimento e i plasmidi della busta e lasciarli riscaldare a temperatura ambiente, pipettare 375 microlitri di optimum in una provetta per microcentrifuga, quindi aggiungere 25 microlitri di reagente di trasfezione HD del gene FU. Assicurarsi che il reagente genico FU sia pipettato direttamente nel terreno e non tocchi il lato della provetta.

Successivamente, in una seconda provetta da microcentrifuga, combinare cinque microgrammi del plasmide di trasferimento, 3,75 microgrammi del plasmide di imballaggio e 1,25 microgrammi del plasmide dell'involucro nella quantità necessaria di ottimale per portare il volume a 100 microlitri. Quindi aggiungere l'Optum Fuji miscelato alla provetta contenente la miscela plasmidica e incubare a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Durante gli ultimi minuti dell'incubazione, aspirare molto delicatamente il terreno dalla piastra contenente le 2 9 3 cellule T e sostituirlo con 10 millilitri di terreno 2 9 3 T fresco privo di antibiotici.

Infine, aggiungere la miscela di plasmidi genici FU goccia a goccia nel terreno della piastra da 10 centimetri. Posizionare la piastra in un incubatore per colture tissutali impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e incubare per una notte. Il giorno successivo, aspirare molto delicatamente il terreno dalla piastra e sostituirlo con un terreno fresco 2 9 3 T privo di antibiotici.

Quindi riposizionare la piastra nell'incubatore di coltura tissutale e incubare per altri due giorni, tre giorni dopo la trasfezione, aspirare il terreno contenente il virus dalla piastra e filtrarlo utilizzando un filtro a basso legame proteico da 0,45 micron. Dopo aver filtrato più strettamente il virus con un virus più stretto, effettuare diluizioni seriali di un virus di controllo fluorescente in terreni freschi privi di antibiotici con sei microgrammi per millilitro di policervello e utilizzare queste diluizioni per trasdurre le cellule della linea cellulare appropriata. Il giorno successivo, in una piastra da 24 pozzetti, sostituire il terreno con un terreno fresco e privo di antibiotici, quindi continuare l'incubazione per altri due giorni per consentire alle cellule di esprimere la proteina fluorescente.

Usa i fatti per determinare la frazione di cellule trasdotte per ogni diluizione virale. Quindi calcolare il titolo in unità di trasformazione per millilitro in base a diluizioni che producono meno del 15% di trasduzione per ridurre al minimo gli eventi di trasduzione multipli. Si presume che le tette di altri lentivirus non fluorescenti prodotti in parallelo siano simili a quelle del virus fluorescente.

Per trasdurre le cellule bersaglio: inizia selezionando un'infezione moltiplicativa maggiore di due per assicurarti che la maggior parte delle cellule venga trasdotta. In primo luogo, diluire il surnatante virale alla molteplicità di infezione richiesta in un terreno di coltura completo fresco. Integrato con sei microgrammi per millilitro di poly brain fino a un volume finale di un millilitro.

Aspirare il terreno da un piatto di 35 millimetri di cellule bersaglio e aggiungere un millilitro di supinato virale diluito. Incubazione dell'incubatore per colture tissutali per 24-48 ore per consentire un'espressione sufficiente del recettore SLC sette A uno, se lo si desidera. Utilizzare la selezione antibiotica con blaster sein per selezionare le cellule trasdotte stabilmente che esprimono SLC sette A uno secondo le istruzioni della procedura scritta.

Per iniziare la determinazione della tossicità, preparare una soluzione madre di 20 milligrammi per millilitro di condroitina solfato e una soluzione madre di 20 milligrammi per millilitro. Poly cervello in acqua e filtro sterile. Le soluzioni madre in eccesso possono essere conservate a meno 20 gradi Celsius fino al momento del bisogno.

Successivamente, determinare il numero di colture cellulari a 96 pozzetti necessarie per determinare con precisione la tossicità del complesso polimerico. Utilizzando il test MTT, almeno sei concentrazioni di condroitina solfato e poliverde devono essere testate in triplicato. Inoltre, cellule non ridotte e cellule cresciute senza siero.

Il terreno deve essere incluso per fornire una linea di base per le cellule sane e per controllare l'arresto della crescita, rispettivamente. Una volta accertato il numero di pozzetti richiesti, la piastra 5.000 cellule bersaglio in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti in celle a piastre parallele in una piastra da 24 pozzetti per l'analisi microscopica o basata sui fatti dell'efficienza di trasduzione in ciascuna condizione sperimentale, consentono a entrambi i set di cellule di crescere durante la notte. Il giorno successivo un'aliquota della soluzione madre di condroitina solfato e un'aliquota della soluzione madre di poli cervello.

Quindi diluire il virus che codifica la GFP in terreni privi di antibiotici contenenti sei microgrammi per millilitro di policervello fino a una molteplicità di infezioni sufficiente a trasdurre circa il 10-50% delle cellule bersaglio per pozzetto. Assicurarsi che ci sia abbastanza virus diluito per ogni condizione di test e che i pozzetti di controllo siano presenti su ogni piastra. Etichettare una serie di provette con ogni concentrazione di condroitina solfato e polimero verde da testare.

Quindi aliquotare una quantità sufficiente di sospensione virale per ogni condizione in triplicato nelle provette. Quindi, pipettare il volume richiesto di condroitina solfato e la soluzione madre di poli cervello per formare le concentrazioni di prova in ciascuna delle provette in successione. Immediatamente dopo l'aggiunta di condroitin solfato e poli verde, agitare il tubo per mescolare.

Lasciare incubare le miscele di poliverdi di condroitina solfato del virus a temperatura ambiente per cinque minuti. La miscela può diventare torbida quando si formano precipitati virali. Dopo l'incubazione, aspirare il terreno dai pozzetti della piastra a 96 pozzetti.

E poi aggiungere la miscela poliverde di condroitina solfato virale ai pozzetti come previsto. Pipettare anche il controllo e i terreni privi di siero nei pozzetti appropriati. Ripetere il processo per l'incubazione della piastra a 24 pozzetti durante la notte nell'incubatore per coltura tissutale.

Quindi, aspirare il terreno contenente il virus dalle piastre e sostituirlo con terreno fresco. Rimettere le piastre nell'incubatrice per un 48 ore Dopo 48 ore. Rimuovere la piastra a 24 pozzetti e utilizzare i dati per analizzare l'efficienza di trasduzione di ciascuna concentrazione di condroitina solfato e poli cervello.

Il giorno seguente. Aspirare il terreno da tutti i pozzetti della piastra a 96 pozzetti e sostituirlo con 100 microlitri di coltura in soluzione di MTT per tre ore in un incubatore umidificato per consentire la riduzione dell'MTT nei mitocondri delle cellule metabolicamente attive. Dopo tre ore, aspirare la soluzione MTT e sostituirla con 200 microlitri di soluzione solvente.

Incubare la piastra per due ore a temperatura ambiente o fino a quando non si forma tutto l'MTT viola e il precipitato si è sciolto. Leggere l'assorbanza su un lettore di micropiastre a 570 nanometri, sottraendo la lettura di fondo a 690 nanometri. La concentrazione ottimale del polimero produrrà il massimo miglioramento della trasduzione come determinato da fatti con un effetto minimo sull'attività metabolica come determinato dall'MTT per hdfs.

100 microgrammi per millilitro di condroitina solfato. Il poly brain è la concentrazione ottimale del polimero determinata con questo metodo. Innanzitutto, preparare una quantità sufficiente di 100 microgrammi per millilitro di condroitina solfato di poliverde virale per trasdurre il numero richiesto di piastre da 35 millimetri di SLC sette un recettore che esprimono cellule HDF Incubare la miscela per cinque minuti per consentire la formazione di complessi polimerici.

Quindi aspirare il terreno dal recettore che esprime le cellule bersaglio e sostituirlo con la miscela virale, incubare per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica dopo aver rimosso la miscela virale. Lavare la superficie delle cellule due volte con PBS per facilitare la rimozione dei complessi virali. La rimozione completa non è necessaria in quanto non sono stati osservati effetti avversi sulla salute delle cellule dai complessi polimerici residui.

Questa immagine al microscopio a fluorescenza illustra una trasduzione sufficiente delle cellule di sarcoma umano, esprimendo stabilmente SLC seven A one con il virus tropico quando si utilizzano vettori di controllo fluorescenti per monitorare l'efficienza della trasduzione. La quantificazione della fluorescenza mediante analisi fax dimostra un'efficienza di trasduzione superiore al 90%I tassi di trasduzione di HDFS sono generalmente inferiori perché le cellule non sono state eliminate in modo selezionato per l'espressione del recettore, le tette di lentivirus atropico sono generalmente dal 10 al 20% del virus pseudo tipizzato VSV sono stati misurati su S-L-C-H-S-C. Il test di vitalità MTT consente di rilevare in modo sensibile l'arresto della crescita nelle cellule bersaglio, come si vede qui, la trasduzione con il virus e le concentrazioni di condroitin solfato.

Poly brain fino a 800 microgrammi per millilitro non hanno alcun effetto sul metabolismo dell'HDF. Analisi via fax di HDFS trasdotta con virus più varie concentrazioni di condroitin solfato. Il verde poli mostra un miglioramento della trasduzione rispetto al solo verde poli.

Il massimo miglioramento si verifica a 100 microgrammi per millilitro. Condroitina solfato poli cervello diverse volte inferiore ai valori precedentemente riportati. Pertanto, è importante ottimizzare le condizioni per qualsiasi tipo di cellula complessata con condroitina solfato.

Il cervello poli aumenta il titolo osservato, circa tre volte in S-L-C-H-S-C. In pratica, ciò produce un effetto maggiore sull'efficienza di trasduzione a basse concentrazioni di virus rispetto a concentrazioni più elevate, il che è molto probabilmente dovuto a più cellule trasdotte e alla saturazione del recettore a concentrazioni di virus più elevate. La trasduzione con il virus tropico è specifica per le cellule che esprimono il recettore del retrovirus neuronale.

Quando si trasducono cellule umane non modificate con fluorescenza del virus tropico maggiore del fondo non ridotto, non è stato osservato come si vede dall'analisi fax al microscopio. Le HDFS non mostrano trasduzione in assenza di recettore, mentre la trasduzione pret con il recettore produce cellule fluorescenti. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordarsi di verificare che il virus non trasduca su cellule umane modificate.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il lentivirus tropicale per fornire geni potenzialmente pericolosi alle cellule umane, incluso l'uso della complessazione polimerica per migliorare la trasduzione.