Visualizzazione e analisi quantitativa dell'attivazione di PARP1/PARP2 indotta da genotossine nelle cellule utilizzando un Reporter a base di proteine a fusione fluorescente

Il nostro laboratorio studia le vie di riparazione del DNA dipendenti da PARP1 e PARP2 e le vie di risposta al danno al DNA in cellule normali e trasformate. Una sfida nel campo è l'analisi quantitativa dell'attivazione di PARP1 e PARP2 nelle cellule, evitando la lisi cellulare. Questo consente studi di localizzazione subcellulare.

Per cominciare, aggiungere 375 microlitri di siero bovino fetale e DMEM privo di Penicillina e Streptomicina in un tubo di microcentrifugazione sterile da 1,5 millilitri. Poi aggiungi 10 microlitri di un reagente di trasfezione a base di lipidi e tutti i plasmidi necessari nel tubo. Tocca delicatamente il tubo di microcentrifugazione per mescolare il mezzo, il reagente di trasfezione e il DNA plasmide.

Incubare a temperatura ambiente per 15-30 minuti per permettere la formazione di DNA e complesso di reagenti di trasfezione. Successivamente, aggiungere la miscela di plasmidi e reagenti per la trasfezione goccia al piatto da 60 millimetri contenente le cellule coltivate da 293FT senza rimuovere il mezzo e riportare le cellule nell'incubatrice per 48 ore. Poi, raccogliere il mezzo di coltura dalle cellule trasfettate da 293FT.

Per isolare le particelle lentivirali, filtrare il mezzo raccolto attraverso un filtro sterile da 0,45 micrometri per separare i detriti cellulari dalle particelle lentivirali. Per la trasduzione, si fanno coltura per 24 ore le cellule desiderate e si verifica che la confluenza cellulare sia tra il 20% e il 40%. Successivamente, aggiungere un millilitro di virus, un millilitro di mezzo di crescita e due microlitri di Polybrene in un tubo conico da 15 millilitri, miscelati delicatamente per inversione. Ora, rimuovi il materiale di crescita dalla lastra a sei pozzi.

Aggiungi la miscela di virus, medium e Polybrene in ogni pozzo. Posizionare le cellule con la miscela di trasduzione in un incubatore contenente un'atmosfera umidificata a 32 gradi Celsius e anidride carbonica al 5% per 16-18 ore. Per validare l'espressione degli amminoacidi RNF146, da 100 a 182 EGFP, seminano 200.000 cellule che esprimono LivePAR per piatto di coltura contenente slimes di copertura.

Lascia alle cellule 24-36 ore ad aderire alle scure di copertura, condiziona il substrato e inizia a replicarsi. Poi espone le cellule che esprimono LivePAR ai reagenti forniti. Aggiungi i composti direttamente al mezzo contenente le cellule sul coperchio e fai girare delicatamente il mezzo nei piatti per coltura cellulare per distribuire i composti.

Incubare i piatti da 60 millimetri a 37 gradi Celsius per 60-90 minuti. Per fissare le cellule, rimuovi il substrato e lava le cellule con PBS. Prefissa le cellule al 4% di formaldeide in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver rimosso il formaldeide, lavare le cellule tre volte con PBS. Poi, aggiungi tre millilitri di metanolo freddo e acetone alle celle in un rapporto 7:3 per fissarlo. Posiziona i piatti a meno 20 gradi Celsius per nove minuti.

Poi, rimuovi la soluzione di metanolo acetone. Dopo aver lavato le cellule tre volte con PBS, pipettare 15 microlitri di mezzo antifade contenente DAPI su un vetrino di vetro. Monta delicatamente il coperchio e slitta sul mezzo di montaggio con le celle rivolte verso l'interno, minimizzando le bolle.

Centra e fissa il coperchio, slitta sul vetrino di vetro e sigilla i lati applicando una piccola quantità di smalto trasparente per unghie ai bordi. Posiziona i vetrini al buio per permettere allo smalto delle unghie di asciugare. Dopo aver scaricato e installato Image J, apri Image J e installa il file di testo macro LivePAR_Macro cliccando su Plugin, selezionando Macros e selezionando Installa.

Apri tutti i file confocali nell'Immagine J e salva i file come file TIFF per preservare quelli originali. Poi, apri un documento di foglio di calcolo e salvalo come Date_CellLineFociAnalysis. Analizza un file TIFF alla volta.

Premi 1 per trovare i nuclei. Quando si apre la finestra del ROI manager, seleziona tutte le voci e premi aggiungi per sovrapporre l'area dei nuclei all'immagine originale. Eliminare i nuclei identificati erroneamente ed escludere quelli che non sono completamente all'interno del sistema di riferimento.

Poi, disegna il nucleo usando lo strumento di selezione a mano libera e premi 2 per quantificare i focus PAR. Seleziona ogni nucleo nel ROI manager e conta il numero di fochi per nucleo. Copia e incolla i dati quantificati nel documento aperto del foglio di calcolo dopo aver valutato tutti i nuclei nel file.

Allo stesso modo, ripeti l'analisi per tutti i file TIFF. Quando hai finito, traccia i focus PAR per nucleo nel software scelto. Le celle di controllo del veicolo hanno mostrato colorazione pancellulare con EGFP.

Le cellule trattate con genotossina hanno mostrato accumulo di fochi nucleari che rappresentano la localizzazione all'interno del nucleo. Il pretrattamento con l'inibitore di PARP1 e PARP2 veliparib ha portato alla perdita dei focus di PAR. La quantificazione del numero di foci PAR per nucleo in funzione del tempo e delle condizioni di trattamento ha mostrato risultati simili.

Questo protocollo ci permette di quantificare l'attivazione degli assi di segnalazione PARP1 e PARP2 in risposta alle genotossine e a modifiche genetiche successive. Abbiamo utilizzato tecniche tradizionali di immunofluorescenza con questo saggio per convalidare la colocalizzazione delle proteine con poliADP-ribosio. In futuro, utilizzeremo questo saggio per test di genotossicità per l'analisi ad alta produttività di PARP1, PARP2 o inibitori di PARP, e per identificare nuovi fattori coinvolti nella segnalazione di PARP1 e PARP2.