Ingegneria delle proteine mediante display superficiale del lievito

Nel mio laboratorio, stiamo progettando terapie cellulari di nuova generazione combinando l'ingegneria proteica con l'ingegneria cellulare. Quindi progettiamo componenti proteici per ottenere nuove funzioni o per migliorare quelle esistenti, e poi incorporiamo queste proteine nulle nelle terapie cellulari. Abbiamo ulteriormente sviluppato la visualizzazione della superficie d'uso per applicazioni specializzate, tra cui l'ingegneria della stabilità delle proteine, l'ingegneria di interruttori proteici regolati da piccole molecole e il targeting specifico delle conferme dei recettori attivati associati al cancro.

Il vantaggio della visualizzazione della superficie del lievito rispetto ad altre tecnologie di visualizzazione, come la visualizzazione dei fagi o dei ribosomi, è la visualizzazione citometrica a flusso della libreria durante il processo di selezione e il controllo preciso delle condizioni di selezione, come la concentrazione dell'antigene e il rigore del cancello di selezione. Per iniziare, prepara le perle per la prima selezione di perline risospendendo 10 microlitri di perle magnetiche leganti di biotina in 990 microlitri di PBSA. Per il lavaggio, posizionare il tubo su una griglia magnetica per due minuti con il coperchio aperto.

Quindi rimuovere con cura il surnatante. Risospendere le perle lavate in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri in un millilitro di PBSA con 6,7-33 picomoli di antigene biotinilato. Dopo l'incubazione, posizionare la provetta su una rastrelliera magnetica per due minuti con il coperchio aperto, rimuovere il surnatante e lavare le perle cariche di antigene con un millilitro di PBSA.

Una volta che le perline si sono depositate, rimuovere il PBSA. Quindi risospendere le perle caricate con antigene in 50 microlitri di PBSA. Preparare le cellule, le perle di antigene e una soluzione di perline di orso per le selezioni negative.

Dopo il lavaggio, risospendere le perle di antigene in 50 microlitri di PBSA e risospendere le perle di orso in 150 microlitri di PBSA. Per la prima selezione negativa, aggiungere 50 microlitri di perle nude lavate a 950 microlitri di cellule lavate in PBSA e incubare la miscela per 1,5 ore a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, posizionare le provette contenenti le sospensioni di perline di orso su un rack magnetico con il coperchio aperto.

Pipettare il liquido nel coperchio nella provetta e attendere due minuti. Quindi trasferire le cellule non legate in una provetta da microcentrifuga fresca e aggiungere 50 microlitri di perline d'orso lavate. Dopo tre cicli di selezione negativa, aggiungere 50 microlitri di soluzione di perline caricate con antigene alle cellule.

Incubare per due ore a quattro gradi Celsius. Posizionare ora le cellule contenenti le perle caricate con l'antigene su una rastrelliera magnetica con il coperchio aperto. Pipettare il liquido presente nel coperchio nella provetta.

Attendere due minuti prima di eliminare le celle non legate. Eseguire tutti i passaggi rimanenti come descritto per la prima selezione della microsfera dell'antigene. Dopo tre selezioni negative e una positiva, risospendere rapidamente le cellule in un millilitro di SDCAA e trasferirle in un pallone di agitazione contenente un volume maggiore di SDCAA.

Dopo l'induzione notturna dell'espressione superficiale delle proteine in SGCAA in librerie di lievito, pellettare abbastanza cellule da coprire 10 volte la diversità e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in PBSA e trasferirlo in provette da microcentrifuga. Utilizzare 30 milioni di cellule per la colorazione in ogni provetta.

Preparare tutte le provette necessarie in base alla diversità, inclusa una provetta di controllo senza l'antigene. Quindi centrifugare le provette a 2000 x g per cinque minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 200 microlitri di PBSA contenente l'antigene e incubare per un'ora a quattro gradi Celsius.

Dopo aver eseguito nuovamente la centrifugazione, rimuovere il PBSA dal pellet. Successivamente, risospendere le cellule in 100 microlitri di PBSA freddo contenente anticorpi per la colorazione del display e il rilevamento dell'antigene. Incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule a 2000 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di PBSA al pellet e ripetere la centrifugazione. Quindi rimuovere la maggior parte del surnatante, lasciando solo 20-30 microlitri per evitare che il pellet si secchi.

Risospendere il pellet in PBSA freddo subito prima dello smistamento. Ora ordina le celle direttamente in SDCAA a medium. Dopo la cernita, trasferire le cellule in un pallone shaker contenente un volume maggiore di terreno SDCAA e incubare a 30 gradi Celsius con agitazione a 180 giri/min.