Ingegneria delle proteine mediante display superficiale del lievito
29 novembre 2024
Questo protocollo descrive i passaggi essenziali per condurre campagne di selezione della superficie del lievito per arricchire le varianti proteiche che si legano a un antigene di interesse.
Nel mio laboratorio, stiamo progettando terapie cellulari di nuova generazione combinando l'ingegneria proteica con l'ingegneria cellulare. Quindi progettiamo componenti proteici per ottenere nuove funzioni o per migliorare quelle esistenti, e poi incorporiamo queste proteine nulle nelle terapie cellulari. Abbiamo ulteriormente sviluppato la visualizzazione della superficie d'uso per applicazioni specializzate, tra cui l'ingegneria della stabilità delle proteine, l'ingegneria di interruttori proteici regolati da piccole molecole e il targeting specifico delle conferme dei recettori attivati associati al cancro.
Il vantaggio della visualizzazione della superficie del lievito rispetto ad altre tecnologie di visualizzazione, come la visualizzazione dei fagi o dei ribosomi, è la visualizzazione citometrica a flusso della libreria durante il processo di selezione e il controllo preciso delle condizioni di selezione, come la concentrazione dell'antigene e il rigore del cancello di selezione. Per iniziare, prepara le perle per la prima selezione di perline risospendendo 10 microlitri di perle magnetiche leganti di biotina in 990 microlitri di PBSA. Per il lavaggio, posizionare il tubo su una griglia magnetica per due minuti con il coperchio aperto.
Quindi rimuovere con cura il surnatante. Risospendere le perle lavate in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri in un millilitro di PBSA con 6,7-33 picomoli di antigene biotinilato. Dopo l'incubazione, posizionare la provetta su una rastrelliera magnetica per due minuti con il coperchio aperto, rimuovere il surnatante e lavare le perle cariche di antigene con un millilitro di PBSA.
Una volta che le perline si sono depositate, rimuovere il PBSA. Quindi risospendere le perle caricate con antigene in 50 microlitri di PBSA. Preparare le cellule, le perle di antigene e una soluzione di perline di orso per le selezioni negative.
Dopo il lavaggio, risospendere le perle di antigene in 50 microlitri di PBSA e risospendere le perle di orso in 150 microlitri di PBSA. Per la prima selezione negativa, aggiungere 50 microlitri di perle nude lavate a 950 microlitri di cellule lavate in PBSA e incubare la miscela per 1,5 ore a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, posizionare le provette contenenti le sospensioni di perline di orso su un rack magnetico con il coperchio aperto.
Pipettare il liquido nel coperchio nella provetta e attendere due minuti. Quindi trasferire le cellule non legate in una provetta da microcentrifuga fresca e aggiungere 50 microlitri di perline d'orso lavate. Dopo tre cicli di selezione negativa, aggiungere 50 microlitri di soluzione di perline caricate con antigene alle cellule.
Incubare per due ore a quattro gradi Celsius. Posizionare ora le cellule contenenti le perle caricate con l'antigene su una rastrelliera magnetica con il coperchio aperto. Pipettare il liquido presente nel coperchio nella provetta.
Attendere due minuti prima di eliminare le celle non legate. Eseguire tutti i passaggi rimanenti come descritto per la prima selezione della microsfera dell'antigene. Dopo tre selezioni negative e una positiva, risospendere rapidamente le cellule in un millilitro di SDCAA e trasferirle in un pallone di agitazione contenente un volume maggiore di SDCAA.
Dopo l'induzione notturna dell'espressione superficiale delle proteine in SGCAA in librerie di lievito, pellettare abbastanza cellule da coprire 10 volte la diversità e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in PBSA e trasferirlo in provette da microcentrifuga. Utilizzare 30 milioni di cellule per la colorazione in ogni provetta.
Preparare tutte le provette necessarie in base alla diversità, inclusa una provetta di controllo senza l'antigene. Quindi centrifugare le provette a 2000 x g per cinque minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 200 microlitri di PBSA contenente l'antigene e incubare per un'ora a quattro gradi Celsius.
Dopo aver eseguito nuovamente la centrifugazione, rimuovere il PBSA dal pellet. Successivamente, risospendere le cellule in 100 microlitri di PBSA freddo contenente anticorpi per la colorazione del display e il rilevamento dell'antigene. Incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule a 2000 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di PBSA al pellet e ripetere la centrifugazione. Quindi rimuovere la maggior parte del surnatante, lasciando solo 20-30 microlitri per evitare che il pellet si secchi.
Risospendere il pellet in PBSA freddo subito prima dello smistamento. Ora ordina le celle direttamente in SDCAA a medium. Dopo la cernita, trasferire le cellule in un pallone shaker contenente un volume maggiore di terreno SDCAA e incubare a 30 gradi Celsius con agitazione a 180 giri/min.
Panoramica
Questo protocollo descrive i passaggi essenziali per condurre campagne di selezione mediante esposizione su lievito al fine di arricchire varianti proteiche che si legano a un antigene di interesse. Il metodo consente un controllo preciso delle condizioni di selezione e una visualizzazione mediante citometria a flusso durante il processo di ordinamento.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Ingegneria Proteica
- Ingegneria Cellulare
- Sviluppo Terapeutico
Sfondo
- La visualizzazione sulla superficie dei lieviti è uno strumento potente per l'ingegnerizzazione delle proteine.
- Permette la visualizzazione di librerie durante il processo di selezione.
- Consente il controllo della concentrazione dell'antigene e della stringenza del sorting.
- È utilizzata in applicazioni come l'ingegnerizzazione della stabilità delle proteine e le terapie mirate.
Scopo dello studio
- Arricchire varianti proteiche che si legano a specifici antigeni.
- Migliorare l'efficienza delle terapie cellulari.
- Sviluppare nuovi interruttori proteici regolati da piccole molecole.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di microsferette magnetiche con legante per la biotina.
- Selezione negativa mediante microsferette nude lavate e cellule.
- Selezione positiva con microsferette caricate con antigene.
- Ordinamento mediante citometria a flusso delle cellule arricchite.
Risultati principali
- Arricchimento riuscito di varianti proteiche che si legano agli antigeni.
- Dimostrazione di controllo sulle condizioni di selezione.
- Ripristino efficiente delle varianti proteiche desiderate per ulteriori studi.
Conclusioni
- La visualizzazione sulla superficie dei lieviti è efficace per la selezione di varianti proteiche.
- Fornisce una piattaforma solida per lo sviluppo di terapie di nuova generazione.
- Facilita i progressi nell'ingegneria proteica e nelle applicazioni terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La visualizzazione sulla superficie dei lieviti consente un'ingegnerizzazione rapida e ad alta fedeltà di varianti proteiche con proprietà di legame migliorate o nuove, supportando direttamente la scoperta terapeutica nelle fasi iniziali. L'integrazione del metodo tra fenotipo e genotipo e la selezione mediante citometria a flusso aumentano la sicurezza predittiva nella validazione delle proteine bersaglio e nell'identificazione dei candidati principali. Questa piattaforma è ampiamente accessibile e scalabile, posizionandosi come una capacità riutilizzabile nei flussi di ingegnerizzazione proteica per la ricerca e sviluppo nel settore biofarmaceutico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche selezionando varianti proteiche con profili di legame desiderati.
- Supporta la riduzione del rischio biologico tramite un controllo preciso della selettività e della concentrazione dell'antigene.
- Semplifica la validazione funzionale della proteina bersaglio collegando il fenotipo proteico al genotipo per analisi successive.
- Migliora l'affidabilità predittiva per la selezione del portafoglio arricchendo i leganti ad alta affinità.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara librerie di proteine espresse in lievito validate per flussi di lavoro di screening successivi.
- Standardizza le condizioni del saggio e migliora la riproducibilità mediante visualizzazione e ordinamento citofluorimetrico.
- Consente una valutazione quantitativa dell'affinità e specificità di legame per una valutazione affidabile dei composti.
- Permette l'arricchimento scalabile e il riutilizzo di varianti proteiche ingegnerizzate in diverse campagne.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea proteine ingegnerizzate a target rilevanti per le malattie, garantendo continuità traslazionale.
- Fornisce una piattaforma robusta per la validazione preclinica di terapie a base proteica.
- Riduce l'ambiguità meccanicistica consentendo la selezione in base a stabilità e attività funzionale.
- Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio mediante dati quantitativi di arricchimento.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La visualizzazione sulla superficie dei lieviti si colloca all'intersezione tra la scoperta iniziale, l'identificazione dei candidati e la validazione preclinica, consentendo un'ottimizzazione iterativa dei farmaci proteici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi selezionando varianti proteiche funzionali.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi e riproducibili per la valutazione dell'affinità e della specificità.
- Analisi: Fornisce dati di citometria a flusso e di sequenziamento per confrontare le prestazioni delle varianti in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase di scoperta a quella preclinica generando candidati con proprietà di legame validate.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma modulare e scalabile, adattabile a diversi obiettivi di ingegneria proteica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nell'ingegneria proteica.
- Valore operativo: Standardizza e ottimizza i flussi di lavoro di selezione per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Consente decisioni informate di prosecuzione o interruzione e una gestione efficiente del portafoglio in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di candidati terapeutici proteici con un'adeguata gestione del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in biologia molecolare e citometria a flusso per un'esecuzione ottimale.
- Necessita dell'accesso a strumentazione citometrica e infrastruttura analitica.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di selezione e di ordinamento.
- Adattabile a diversi bersagli proteici e sistemi modello mediante adeguamenti del protocollo.
- Dipende dalla diversità della libreria e dalla disponibilità dell'antigene per il successo della campagna.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
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Introduction
0:52
Yeast Surface Display Selection Using Magnetic Beads
1:57
Second Bead Selection Round with 3 Negative and 1 Positive Selection
3:43
Flow Cytometric Sorting for Yeast Surface Display Selection of the Fn3-Based G4 Library for Binding to the Antigen
