Ingegneria delle proteine mediante display superficiale del lievito
November 29th, 2024
Questo protocollo descrive i passaggi essenziali per condurre campagne di selezione della superficie del lievito per arricchire le varianti proteiche che si legano a un antigene di interesse.
Nel mio laboratorio, stiamo progettando terapie cellulari di nuova generazione combinando l'ingegneria proteica con l'ingegneria cellulare. Quindi progettiamo componenti proteici per ottenere nuove funzioni o per migliorare quelle esistenti, e poi incorporiamo queste proteine nulle nelle terapie cellulari. Abbiamo ulteriormente sviluppato la visualizzazione della superficie d'uso per applicazioni specializzate, tra cui l'ingegneria della stabilità delle proteine, l'ingegneria di interruttori proteici regolati da piccole molecole e il targeting specifico delle conferme dei recettori attivati associati al cancro.
Il vantaggio della visualizzazione della superficie del lievito rispetto ad altre tecnologie di visualizzazione, come la visualizzazione dei fagi o dei ribosomi, è la visualizzazione citometrica a flusso della libreria durante il processo di selezione e il controllo preciso delle condizioni di selezione, come la concentrazione dell'antigene e il rigore del cancello di selezione. Per iniziare, prepara le perle per la prima selezione di perline risospendendo 10 microlitri di perle magnetiche leganti di biotina in 990 microlitri di PBSA. Per il lavaggio, posizionare il tubo su una griglia magnetica per due minuti con il coperchio aperto.
Quindi rimuovere con cura il surnatante. Risospendere le perle lavate in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri in un millilitro di PBSA con 6,7-33 picomoli di antigene biotinilato. Dopo l'incubazione, posizionare la provetta su una rastrelliera magnetica per due minuti con il coperchio aperto, rimuovere il surnatante e lavare le perle cariche di antigene con un millilitro di PBSA.
Una volta che le perline si sono depositate, rimuovere il PBSA. Quindi risospendere le perle caricate con antigene in 50 microlitri di PBSA. Preparare le cellule, le perle di antigene e una soluzione di perline di orso per le selezioni negative.
Dopo il lavaggio, risospendere le perle di antigene in 50 microlitri di PBSA e risospendere le perle di orso in 150 microlitri di PBSA. Per la prima selezione negativa, aggiungere 50 microlitri di perle nude lavate a 950 microlitri di cellule lavate in PBSA e incubare la miscela per 1,5 ore a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, posizionare le provette contenenti le sospensioni di perline di orso su un rack magnetico con il coperchio aperto.
Pipettare il liquido nel coperchio nella provetta e attendere due minuti. Quindi trasferire le cellule non legate in una provetta da microcentrifuga fresca e aggiungere 50 microlitri di perline d'orso lavate. Dopo tre cicli di selezione negativa, aggiungere 50 microlitri di soluzione di perline caricate con antigene alle cellule.
Incubare per due ore a quattro gradi Celsius. Posizionare ora le cellule contenenti le perle caricate con l'antigene su una rastrelliera magnetica con il coperchio aperto. Pipettare il liquido presente nel coperchio nella provetta.
Attendere due minuti prima di eliminare le celle non legate. Eseguire tutti i passaggi rimanenti come descritto per la prima selezione della microsfera dell'antigene. Dopo tre selezioni negative e una positiva, risospendere rapidamente le cellule in un millilitro di SDCAA e trasferirle in un pallone di agitazione contenente un volume maggiore di SDCAA.
Dopo l'induzione notturna dell'espressione superficiale delle proteine in SGCAA in librerie di lievito, pellettare abbastanza cellule da coprire 10 volte la diversità e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in PBSA e trasferirlo in provette da microcentrifuga. Utilizzare 30 milioni di cellule per la colorazione in ogni provetta.
Preparare tutte le provette necessarie in base alla diversità, inclusa una provetta di controllo senza l'antigene. Quindi centrifugare le provette a 2000 x g per cinque minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 200 microlitri di PBSA contenente l'antigene e incubare per un'ora a quattro gradi Celsius.
Dopo aver eseguito nuovamente la centrifugazione, rimuovere il PBSA dal pellet. Successivamente, risospendere le cellule in 100 microlitri di PBSA freddo contenente anticorpi per la colorazione del display e il rilevamento dell'antigene. Incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule a 2000 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di PBSA al pellet e ripetere la centrifugazione. Quindi rimuovere la maggior parte del surnatante, lasciando solo 20-30 microlitri per evitare che il pellet si secchi.
Risospendere il pellet in PBSA freddo subito prima dello smistamento. Ora ordina le celle direttamente in SDCAA a medium. Dopo la cernita, trasferire le cellule in un pallone shaker contenente un volume maggiore di terreno SDCAA e incubare a 30 gradi Celsius con agitazione a 180 giri/min.
Panoramica
Questo protocollo descrive i passaggi essenziali per condurre campagne di selezione di display superficiale di lievito per arricchire le varianti proteiche che si legano a un antigene di interesse. Il metodo permette un controllo preciso delle condizioni di selezione e la visualizzazione flow citometrica durante il processo di ordinamento.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Ingegneria proteica
- Ingegneria cellulare
- Sviluppo terapeutico
Sfondo
- Il display superficiale di lievito è uno strumento potente per l'ingegneria proteica.
- Permette la visualizzazione delle biblioteche durante l'ordinamento.
- Consente il controllo della concentrazione dell'antigene e della severità dell'ordinamento.
- Utilizzato per applicazioni come l'ingegneria della stabilità proteica e le terapie mirate.
Scopo dello studio
- Arricchire le varianti proteiche che si legano a specifici antigeni.
- Migliorare l'efficienza delle terapie cellulari.
- Sviluppare nuovi interruttori proteici regolati da piccole molecole.
Metodi utilizzati
- Preparazione di perle magnetiche leganti la biotina.
- Seleziona negativa utilizzando perle nude lavate e cellule.
- Seleziona positiva con perle caricate di antigene.
- Ordinamento flow citometrico delle cellule arricchite.
Risultati principali
- Arricchimento di successo delle varianti proteiche che si legano agli antigeni.
- Controllo dimostrato sulle condizioni di selezione.
- Recupero efficiente delle varianti proteiche desiderate per ulteriori studi.
Conclusioni
- Il display superficiale di lievito è efficace per la selezione delle varianti proteiche.
- Fornisce una piattaforma robusta per lo sviluppo di terapie di prossima generazione.
- Facilita progressi nell'ingegneria proteica e nelle applicazioni terapeutiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Yeast surface display enables rapid, high-fidelity engineering of protein variants with improved or novel binding properties, directly supporting early-stage therapeutic discovery. The method's integration of phenotype-genotype linkage and flow cytometric selection enhances predictive confidence in target validation and lead identification. This platform is broadly accessible and scalable, positioning it as a reusable capability for protein engineering pipelines in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by selecting protein variants with desired binding profiles.
- Supports biological de-risking through precise control of selection stringency and antigen concentration.
- Facilitates functional target validation by linking protein phenotype to genotype for downstream analysis.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by enriching high-affinity binders.
Screening & Assay Development
- Prepares validated yeast-displayed protein libraries for downstream screening workflows.
- Standardizes assay conditions and enhances reproducibility via flow cytometric visualization and sorting.
- Enables quantitative assessment of binding affinity and specificity for reliable compound evaluation.
- Supports scalable enrichment and reuse of engineered protein variants across campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered proteins with disease-relevant targets for translational continuity.
- Provides a robust platform for preclinical validation of protein-based therapeutics.
- Reduces mechanistic ambiguity by enabling selection for stability and functional activity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative enrichment data.
Pipeline & Workflow Integration
Yeast surface display fits at the intersection of early discovery, lead identification, and preclinical validation, enabling iterative optimization of protein therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by selecting for functional protein variants.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for affinity and specificity assessment.
- Analytics: Provides flow cytometric and sequencing data to compare variant performance across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by generating candidates with validated binding properties.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable platform adaptable to diverse protein engineering objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein engineering.
- Operational Value: Standardizes and streamlines selection workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of protein therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and flow cytometry for optimal execution.
- Needs access to flow cytometric instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of selection and sorting protocols.
- Adaptable to various protein targets and model systems with protocol adjustments.
- Dependent on library diversity and antigen availability for campaign success.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:52
Yeast Surface Display Selection Using Magnetic Beads
1:57
Second Bead Selection Round with 3 Negative and 1 Positive Selection
3:43
Flow Cytometric Sorting for Yeast Surface Display Selection of the Fn3-Based G4 Library for Binding to the Antigen
