Name: Ingegneria delle proteine mediante display superficiale del lievito (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Scopri l'ingegneria delle proteine mediante display superficiale del lievito per arricchire varianti che legano antigeni specifici. Questo metodo offre controllo preciso delle condizioni di selezione e visualizzazione citofluorimetrica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Ottimizzazione delle funzioni proteiche attraverso tecniche di visualizzazione della superficie del lievito

La visualizzazione della superficie del lievito è una delle tecnologie chiave nel campo dell'ingegneria proteica. Consente la selezione di varianti proteiche con le proprietà desiderate, come una migliore affinità o stabilità. Introdotta per la prima volta nel 19971, è una delle tecnologie di visualizzazione più comunemente utilizzate oltre al phage display 2,3, al ribosomidisplay 4 e al display delle cellule di mammifero 5,6,7. La proteina di interesse (POI) viene visualizzata sulla superficie delle cellule di lievito fondendola per ancorare le proteine. È disponibile una gamma di diverse proteine di ancoraggio e, più comunemente, il POI è fuso con il C-terminale della proteina di accoppiamento dell'agglutinina di lievito Aga2p 1,8. Inoltre, il POI è tipicamente affiancato da due tag, come un tag per emoagglutinina (HA-tag) e un tag c-myc, che consente il rilevamento del livello di visualizzazione utilizzando anticorpi marcati in fluorescenza e citometria a flusso (Figura 1A). Le tipiche campagne di selezione dei lieviti prevedono una combinazione di selezioni di biglie magnetiche e selezione citofluorimetrica. Le selezioni delle microsfere consentono la gestione di un numero elevato di cellule e l'arricchimento di varianti proteiche che si legano all'antigene bersaglio anche con basse affinità poiché le interazioni multivalenti con le perle caricate con l'antigene portano a effetti di avidità e, quindi, prevengono la perdita di varianti a bassa affinità (Figura 1B). L'analisi citofluorimetrica e la selezione offrono il vantaggio di visualizzare il legame delle varianti di POI visualizzate all'antigene marcato. Di conseguenza, le popolazioni leganti possono essere ordinate e coltivate, portando all'arricchimento di varianti proteiche con le caratteristiche desiderate durante diversi cicli di selezione. Inoltre, è possibile eseguire ulteriori cicli di mutagenesi casuale per aumentare ulteriormente la diversità e, quindi, la probabilità di trovare ulteriori mutazioni che contribuiscono all'affinità e/o alla stabilità della proteina.
L'esposizione della superficie del lievito presenta alcuni vantaggi, come (a) il macchinario di espressione eucariotico, che consente il ripiegamento ossidativo delle proteine e le modificazioni post-traduzionali eucariotiche (come la N-glicosilazione), (b) la normalizzazione dell'espressione dovuta al rilevamento dei due tag peptidici che fiancheggiano la proteina, (c) l'ispezione visiva dell'andamento della selezione mediante citometria a flusso (ad esempio, percentuale di cellule leganti e intensità di legame) e (d) la possibilità di analizzare singoli mutanti proteici su lievito (ad esempio, analizzando la termostabilità e l'affinità), presentando un'alternativa che consente di risparmiare tempo alla laboriosa espressione e purificazione delle proteine9. Infatti, sia le affinità (valori KD) che le stabilità (valori T50) delle proteine mostrate sulla superficie del lievito hanno mostrato buone correlazioni con i dati ottenuti utilizzando metodi biofisici e proteine solubili 9,10,11,12. Il display superficiale del lievito è stato impiegato per l'ingegnerizzazione di una varietà di proteine, ad esempio frammenti di anticorpi 13,14,15,16, il 10° dominio di fibronectina di tipo III 17,18, rcSso7d19,20 o noctine21. Allo stesso modo, sono state intraprese ricerche approfondite per ottimizzare i disegni delle librerie di lievito modificando le posizioni randomizzate e l'utilizzo del codone degli amminoacidi 17,22,23. La visualizzazione della superficie del lievito si è dimostrata efficace per l'ingegneria della stabilità 14,15,24,25, dell'affinità 18,26,27, dell'attività enzimatica 28,29,30,31 e dell'espressione proteica32. Inoltre, applicazioni più sofisticate come il legame condizionale in presenza o assenza di una piccola molecola sono state realizzate utilizzando il display di superficie del lievito20.
In questo protocollo, descriviamo tutti i passaggi essenziali per una campagna di selezione con display della superficie del lievito con l'esempio della libreria G4 (basata sul 10° dominio della fibronectina di tipo III, Fn3) selezionata contro l'antigene umano retinol-binding protein 4 (hRBP4) in presenza della piccola molecola A112020. Questa selezione è stata condotta per produrre un'interazione proteina-proteina che dipende da una piccola molecola che può essere utilizzata come interruttore molecolare. Da notare che, mentre sono possibili approcci alternativi con la visualizzazione della superficie del lievito, le tipiche selezioni di lievito di solito mirano a legarsi a un antigene bersaglio senza alcuna precedente affinità di legame. Copriamo tutte le fasi di una campagna di selezione del lievito, che prevede la coltivazione di una libreria di lieviti, la selezione delle sfere, la selezione citofluorimetrica e la maturazione per affinità mediante PCR soggetta a errori (epPCR). Pertanto, questo protocollo integra i precedenti protocolli di visualizzazione della superficie del lievito33,34 e può essere utilizzato come base per le selezioni di visualizzazione della superficie del lievito (Figura 1) con qualsiasi libreria di lievito e antigene target di scelta.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig1v5.jpg"> 
Figura 1: Principio della visualizzazione della superficie del lievito e un flusso di lavoro tipico per le selezioni della visualizzazione della superficie del lievito. (A) Il POI viene clonato in un vettore di visualizzazione della superficie del lievito e tipicamente affiancato da un HA N-terminale e da un c-myc-tag C-terminale. Il costrutto è fuso con la proteina di accoppiamento del lievito Aga2p per essere visualizzato sulla superficie. La proteina raffigurata è il legante ingegnerizzato "RS3" da PDB ID: 6QBA20. (B) Diagramma di flusso che illustra un flusso di lavoro tipico per le campagne di selezione della visualizzazione della superficie del lievito, che combinano l'arricchimento delle varianti proteiche con le proprietà desiderate mediante selezioni di perle e selezione citometrica a flusso, nonché epPCR per la maturazione per affinità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig1largev5.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>10-beta elettrocompetente E. coli&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C3020K</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Carl Roth</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina sale sodico</td><td>Carl Roth</td><td>K029.2</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-c-myc, clone 9E10, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A488 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-c-myc, clone 9E10, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A647 (Thermo Fisher)</td>Anticorpo anti-HA,<td></td></tr><tr><td> clone 16B12, AF488</td><td>BioLegend</td><td>901509 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-HA, clone 16B12, AF647</td><td>BioLegend</td><td>682404 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina, frazione di etanolo a freddo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico monoidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>D-Galattosio</td><td>Carl Roth</td><td>4987.2</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Difco lievito base azotata</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Di-Sodio idrogeno fosfato eptaidrato</td><td>Carl Roth</td><td>X987.3</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitolo</td><td>Carl Roth</td><td>6213.1</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s soluzione salina tamponata con fosfato (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Biotin Binder</td><td>Invitrogen</td><td>11047 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EBY100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta per elettroporazione 1 mm (per E.coli)</td><td>VWR</td><td>732-1135</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta per elettroporazione 2 mm (per lievito)</td><td>VWR</td><td>732-1136</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>MERCK</td><td>1070172511</td><td></td></tr><tr><td>GeneMorph II Kit per mutagenesi casuale</td><td>Agilent Technologies</td><td>200550</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Casamino Acids</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>223120</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>131339.1211</td><td></td></tr><tr><td>LE agarosio nbsp;</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di litio diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Monarch DNA Gel Estrazione Kit</td><td>NEB</td><td>T1020S</td><td></td></tr><tr><td>Monarch PCR & Kit di pulizia del DNA</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge 1S-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita</td><td>NEB</td><td>B9035S</td><td></td></tr><tr><td>pCTCON2</td><td>Addgene</td><td>#41843</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina G sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Penta-His anticorpo, AF488</td><td>Qiagen</td><td>35310</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Penta-Hi, AF647</td><td>Qiagen</td><td>35370</td><td></td></tr><tr><td>Peptone ex caseina digerito tritticamente</td><td>Carl Roth</td><td>8986.3</td><td></td></tr><tr><td>Q5 DNA polimerasi ad alta fedeltà&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>SaII-HF</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodio diidrogeno fosfato monoidrato</td><td>Carl Roth</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>Filtro filettato Steritop per bottiglie</td><td>MERCK</td><td>S2GPT01RE</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>S32354 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisodico diidrato</td><td>Carl Roth</td><td>4088.1</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-Vis</td><td>Agilent</td><td>8453</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito, micro-granulato</td><td>Carl Roth</td><td>2904.4</td><td></td></tr><tr><td>Zymoprep lievito plasmide Miniprep II</td><td>Zymo Research</td><td>D2004&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

ingegneria delle proteine mediante display superficiale del lievito

Protein Engineering by Yeast Surface Display

La libreria G4 è stata selezionata contro l'antigene hRBP4 legato al farmaco a piccola molecola A1120. La colorazione delle librerie per la selezione citofluorimetrica è stata eseguita come descritto nel Metodo 6 e la strategia di gating applicata è mostrata nella Figura 2A. Un gate iniziale includeva tutte le cellule in base alla morfologia cellulare e il secondo gate (istogramma di FSC-Width) mostrava una rigorosa strategia di gating che è stata applicata per selezionare singole cellule e rimuovere gli aggregati cellulari. Il terzo e ultimo gate ha mostrato la visualizzazione delle varianti proteiche (asse x) rispetto al legame dell'antigene (asse y). Sono state ordinate le cellule di lievito che mostravano sia segnali di visualizzazione che di legame. È importante sottolineare che il cancello di smistamento è stato impostato in modo rigoroso per arricchire i domini di legame con un segnale di legame elevato e quindi un'elevata affinità. Questa rigorosa selezione ha prodotto un arricchimento di cellule di lievito che si legano specificamente all'antigene bersaglio durante la campagna di selezione (Figura 2B). Nei successivi cicli di selezione citofluorimetrica, la concentrazione di antigene è diminuita di 10 volte (da 100 nM a 10 nM). Pertanto, il segnale di legame complessivo è stato ridotto e solo i leganti con un'elevata affinità erano ancora rilevabili e ordinati (Figura 2C).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig2v5.jpg"> 
Figura 2: Risultati rappresentativi di una selezione della libreria G4 basata su Fn3 per il legame all'antigene (hRBP4 in presenza di A1120). (A) La strategia generale di gating per il sorting delle librerie di lievito. La prima porta (FSC vs. SSC) consiste nel selezionare tutte le cellule di lievito ed escludere gli eventi di dispersione; il secondo cancello (istogramma di FSC-W) mira a rimuovere gli aggregati cellulari e selezionare solo singole cellule di lievito. Il terzo gate traccia il livello di visualizzazione superficiale (rilevamento del tag HA o c-myc) rispetto al legame con l'antigene (qui hRBP4 in presenza di 5 μM A1120, rilevato dall'anticorpo anti-Hi). La libreria è stata inoltre colorata con solo anticorpi secondari (senza antigene), dove non è previsto alcun legame con l'antigene. Le celle ordinate sono evidenziate in blu. (B) Evoluzione della libreria G4 attraverso 3 cicli di smistamento citofluorimetrico. L'arricchimento della popolazione di legame può essere osservato ad ogni ciclo di selezione. (C) L'uso di concentrazioni di antigene più basse consente la selezione di varianti proteiche con una maggiore affinità verso l'antigene bersaglio. Dopo la riduzione della concentrazione dell'antigene (qui hRBP4) di 10 volte, compaiono diverse diagonali, che indicano la presenza di cloni con affinità maggiore (cellule selezionate, blu) o inferiore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig2largev5.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Ingegneria delle proteine mediante display superficiale del lievito

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

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