High-throughput screening funzionale utilizzando una casalinga Dual-glow Luciferase Assay

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare i regolatori trascrizionali di qualsiasi gene di interesse utilizzando un semplice protocollo di trasfezione ad alto rendimento e un saggio di luciferasi a doppio bagliore fatto in casa. Ciò si ottiene progettando e clonando prima un set unico di plasmidi reporter a doppia luciferasi. Questi plasmidi sono trasfettati in 2 9 3 cellule T in micropiastra con plasmidi provenienti da una libreria di espressione del DNA, in modo tale che ogni pozzetto sia trasfettato con un singolo plasmide di libreria.

Dopo 48 ore, viene analizzata l'attività della luciferasi Firefly, seguita da un test dell'attività della luciferasi vaniglia. Il passaggio finale consiste nel calcolare i rapporti di attività tra lucciola e luciferasi vaniglia. In definitiva, l'induzione relativa del gene di interesse in risposta a ciascuna libreria.

Il gene è dedotto dal rapporto tra lucciola, e l'attività della luciferasi di vaniglia in ciascun pozzetto dopo la normalizzazione basata su piastra. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai protocolli di analisi reporter esistenti è la sua capacità di generare rapidamente dati funzionali per un gran numero di geni con manodopera e costi minimi. Un giorno prima della trasfezione designata come primo giorno dello schermo, 2 9 3 cellule T vengono inserite in 96.

Le cellule delle piastre a pozzetti vengono dimensionate, contate e risospese a una concentrazione di 1,5 volte 10 per la quinta cellula per millilitro. Nel DMEM contenente il 14% di FBS, versare le cellule in un serbatoio sterile. Posizionare il serbatoio, sei piastre a fondo trasparente da 96 pozzetti e una scatola di puntali per pipette con filtro sul ponte del robot del manipolatore automatico di liquidi.

Due piastre di celle devono essere posizionate per ogni piastra della libreria da schermare. Erogare 100 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di ciascuna piastra per una densità di 1,5 volte 10 per la quarta cella per pozzetto. In questa dimostrazione verranno proiettate tre tavole della libreria.

Quindi, vengono preparate sei piastre di cellule: centrifugare le piastre cellulari a 50 volte G per due minuti utilizzando basse velocità di rampa per garantire la stessa densità di celle in ogni pozzetto. Questa immagine illustra l'aspetto delle celle piastrate dopo la centrifugazione. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 10% di anidride carbonica durante la notte.

Per preparare i plasmidi reporter firefly e vanilla, diluire ciascuno a cinque nanogrammi per microlitro in acqua priva di endotossine in un tubo conico da 15 millilitri. Combina le diluizioni in un rapporto da cinque a tre lucciola per plasmide di vaniglia in volume. Pipettare i plasmidi combinati in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, erogando 17 microlitri per piastra da libreria, più da due a 10 microlitri in eccesso in ciascun pozzetto, le cellule vengono trasfettate il secondo giorno dello schermo.

Per iniziare questa procedura, per ogni piastra di libreria, mescolare 107,5 microlitri di difetto op a temperatura ambiente con 4,3 millilitri di terreno privo di siero, una diluizione da uno a 40 in una provetta di polistirene, incubare per cinque minuti a temperatura ambiente, erogare 44 microlitri per piastra di libreria in ciascun pozzetto di una piastra con fondo a V in polistirene a 96 pozzetti. Posizionare la piastra DNA della libreria, la piastra diluita dell'effetto opt, la piastra plasmidico reporter e una scatola di puntali per pipette sul ponte robotico aspirato. 17 microlitri di plasmidi reporter, 43 microlitri di effetto opt diluito e 26 microlitri di DNA di libreria, inserendo un traferro di cinque microlitri tra ogni aspirazione.

Il DNA della libreria deve essere aspirato per ultimo per evitare la contaminazione incrociata. Erogare il contenuto dei puntali in un nuovo coperchio di polistirene con fondo a V e mettere da parte per 20 minuti per consentire la formazione di complessi lipidici di DNA. Se si esegue il sezionamento di più piastre di libreria, sostituire i puntali della pipetta e la piastra della libreria e ripetere dopo 20 minuti, scoprire la piastra di miscelazione del DNA con effetto opt e posizionarla sul ponte del robot con due piastre da 2 9 3 cellule T utilizzando una singola scatola di puntali per pipette.

Aspirare 80 microlitri della miscela di DNA ad effetto opt ed erogare lentamente 40 microlitri per pozzetto per ogni piastra di cellule. Coprire le cellule dopo che la miscela di DNA ad effetto opt è stata aggiunta alle cellule in tutte le piastre. Centrifugare le piastre a 1, 200 volte G per 30 minuti.

Rimetti le piastre nell'incubatore e incuba le cellule per quattro-sei ore. Durante questa incubazione, preparare un terreno fresco mescolando 12 millilitri di DMEM contenente il 10% di FBS e 10 microgrammi per millilitro di ciprofloxina. Per ogni piastra della libreria trasfettata, versare i nuovi terreni in un serbatoio sterile.

Successivamente, posiziona due scatole di punte robotiche, una singola piastra di celle, il serbatoio contenente i terreni freschi e un serbatoio di scarto sul ponte del robot. Quindi aspirare 100 microlitri di terreno dalle celle ed erogare nel serbatoio di scarico, parzialmente riempito con etanolo al 70%. Utilizzando punte fresche, aspirare 100 microlitri di terreno fresco ed erogare lentamente sulle cellule.

Rimettere le piastre nell'incubatrice per 48 ore. Vengono eseguiti i saggi della lucciola e della luciferasi della vaniglia. 48 ore dopo il trasfetto del quarto giorno dello schermo per ciascuna piastra della libreria, preparare otto millilitri di tre tamponi per il saggio Firefly e 12 millilitri di tre tamponi per il saggio alla vaniglia dalle rispettive soluzioni madre Erogare 82 microlitri di tampone per il saggio Firefly in ciascun pozzetto di una piastra con fondo a V da 96 pozzetti per ogni piastra della libreria da analizzare.

Allo stesso modo, erogare 122 microlitri di tampone per il saggio della vaniglia in ciascun pozzetto di un'altra piastra con fondo a V da 96 pozzetti. Per ogni piastra da analizzare, mettere da parte entrambi i tamponi di analisi. Posizionare una scatola di puntali per pipette, un serbatoio di scarto e due piastre di cellule trasfettate dalla stessa piastra della libreria sul ponte del robot, aspirare 60 microlitri di terreno da ciascuna piastra e gettare nel serbatoio di scarto parzialmente riempito con piastre di copertura in etanolo al 70% e mettere da parte.

Quindi posizionare due scatole di puntali per pipette. La piastra di tre tamponi per il saggio delle lucciole e una serie di piastre cellulari sul ponte del robot. Aspirare 40 microlitri di tre tamponi per il saggio delle lucciole e aggiungerlo alla prima piastra di cellule, mescolando accuratamente.

Passaggio a nuovi puntali per pipette. Ripetere per la seconda piastra cellulare. Porre le cellule a temperatura ambiente per 10 minuti per completare la lisi.

Registrare la luminescenza da ogni pozzetto di ciascuna piastra cellulare sul luminometro registrando per un secondo per pozzetto. Riportare le piastre nel ponte del robot. Posizionare due scatole di puntali per pipette, la piastra di tre tamponi per saggi e una serie di piastre per celle sul ponte del robot.

Aspirare 60 microlitri di tre tamponi per il saggio della vaniglia e aggiungerli alla prima piastra di cellule. Mescolando accuratamente. Passaggio a una nuova scatola di puntali per pipette.

Ripetere per la seconda piastra cellulare. Registra la luminescenza di tutte le lastre su un luminometro. Registrazione di ogni pozzetto per un secondo.

I valori tipici di luciferasi per una singola semipiastra sono mostrati in queste tabelle. Il rapporto di luminescenza tra lucciola e rinnovo o il rapporto F due R per ciascun pozzo è calcolato dividendo i conteggi del segnale di lucciola per i conteggi del segnale di rinnovo eseguito e i risultati sono mostrati nel pannello C.Il pannello D mostra il valore di induzione per ciascun pozzetto calcolato dividendo il rapporto F due R del pozzetto per il rapporto medio F due R della piastra, escludendo il 25% più alto e più basso dei pozzi. I valori di induzione devono essere mediati tra le repliche per una singola piastra di libreria trasfettata.

E i geni che inducono o reprimono l'alfa sinucleina più di tre volte sono considerati colpi. Si noti l'induttore di 32 volte nel pozzetto H, due in questo risultato rappresentativo mostrato qui è una rappresentazione grafica dei valori di induzione per la singola piastra con il pozzetto H due evidenziato in blu. Hi.H two è un fattore di trascrizione neuronale non precedentemente associato all'espressione dell'alfa sinucleina.

È importante verificare che lo screening venga eseguito all'interno dell'intervallo lineare dei saggi reporter in modo che i cloni che causano un aumento dell'espressione vengano misurati man mano che l'aumento dell'attività della luciferasi a questo punto le cellule sono state trasfettate con quantità crescenti di plasmidi di luciferasi di lucciola e vaniglia sotto il controllo del forte promotore e saggio H-C-M-V-I-E one. Con questo protocollo, è stato osservato che l'attività delle lucciole rimane lineare attraverso un'ampia gamma di valori. Mentre la curva per l'attività della vaniglia si appiattisce sopra i 15 nanogrammi per pozzetto.

È inoltre importante eseguire i saggi subito dopo la fase di incubazione per evitare la non linearità dovuta all'esaurimento del substrato. Un segnale di decadimento per il saggio della luciferasi della lucciola ha rivelato una significativa attività della luciferasi della lucciola fino a un'ora dopo l'aggiunta di reagenti utilizzando questo protocollo, 7.670 geni umani sono stati sottoposti a screening e 68 nuovi regolatori dell'alfa sinucleina sono stati infine identificati nei risultati rappresentativi mostrati qui. Ogni linea orizzontale rappresenta il rapporto di induzione di un singolo gene colpito rispetto a un induttore neutro GFP controllato.

Le linee blu rappresentano gli induttori positivi, mentre l'unica linea rossa rappresenta un soppressore, i valori di induzione sono calcolati come il rapporto tra il promotore dell'alfa sinucleina che guida l'attività della luciferasi della lucciola e il promotore del CMV che guida l'attività della luciferasi di ciascun colpo normalizzato allo stesso test dei costrutti di luciferasi utilizzando un induttore GFP Seguendo questa procedura. Altri metodi, come la PCR quantitativa, in combinazione con ulteriori saggi di sovraespressione e knockdown, possono essere eseguiti per garantire che i colpi identificati regolino il bersaglio endogeno.