Name: Preparazione, purificazione e caratterizzazione di complessi lantanidi per luso di agenti di contrasto per Risonanza Magnetica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Impara a sintetizzare, purificare e caratterizzare complessi di lantanidi per l'imaging biologico mediante risonanza magnetica. Questo metodo consente di marcare macromolecole con agenti di contrasto purificati.

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Noi riconosciamo con gratitudine fondi avvio da Wayne State University (MJA), una borsa di studio dalla Fondazione Americana per Aging Research (SMV), e un percorso di transizione Career Award Indipendenza (R00EB007129) dal National Institute of Biomedical Imaging e Bioingegneria del National Institutes della Sanità (MJA).

1. Metalation utilizzando LnCl 3 sali <ol><li> Sciogliere il ligando in acqua per produrre una soluzione di 30-265 mM. Il ligando 2 - (4-isothiocyanatobenzyl)-dietilentriammina acido pentaacetic (p-SCN-Bn-DTPA) è stato utilizzato in questo video in una concentrazione di 73 mm. </li><li> Regolare il pH della soluzione di ligando compreso tra 5,5 e 7,0 con l'aggiunta di 1 M NH 4 OH. In questo video, 0,2 ml di M 1 soluzione di NH 4 OH è stato utilizzato. </li><li> Sciogliere 1-2 equivalenti di LnCl 3 in acqua per produrre una soluzione con una concentrazione di 5.000-1.000 mM. In questo video, EuCl GdCl 3 e 3 sono stati usati in concentrazioni di 111 mm. Un eccesso di metallo è spesso usato per guidare il metalation di completamento e di conseguenza semplificare purificazione. </li><li> Aggiungere la soluzione di LnCl 3 per la soluzione del ligando mescolando. </li><li> Dopo l'aggiunta di LnCl 3, regolare il pH della miscela di reazione risultante tra 5,5 e 7,0 con l'aggiunta di 0,2 M di NH 4 OH. Un totale di 0,5 ml di 0,2 M soluzione di NH 4 OH è stato utilizzato in questo video. Se il legante contiene gruppi funzionali sensibili agli acidi, regolare il pH più volte durante questa fase. ATTENZIONE - Se la soluzione diventa troppo di base, tutti i gruppi di base sensibili funzionali, come isotiocianato, sarà reso inutilizzabile per coniugazione. </li><li> Monitorare la reazione attraverso misure di pH. La reazione è completa quando il pH rimane costante. </li></ol> 2. PH iter Raising (non incluso in questo video, ma buona per ligandi senza gruppi funzionali di base e minuscole) <ol><li> Aggiungi concentrato NH 4 OH alla miscela di reazione per regolare il pH a ≥ 11. Questo passo precipitare qualsiasi metallo uncomplexed come idrossido insolubile. </li><li> Filtrare il surnatante attraverso un filtro 0,2 micron. Se la miscela di reazione intasa il filtro, centrifugazione e decantazione prima di filtraggio è raccomandato. </li><li> Se la dialisi non verrà eseguita, rimuovere il solvente a pressione ridotta (evaporazione rotante o liofilizzazione è consigliato). </li><li> Passi 2,1-2,3 può essere ripetuto se lantanidi libero rimane. </li></ol> 3. Dialisi workup <ol><li> Tagliare il tubo dialisi ad una lunghezza appropriata (seguire le linee guida del produttore) per tenere il volume del campione, lasciando lunghezza in più (circa il 10% del volume del campione). In questo video, un 100-500 dalton peso molecolare di cut-off (MWCO) membrana è stata utilizzata, ma più grandi tubi MWCO può essere utilizzato come coniugazione appropriata se viene eseguita prima di metalation. Inoltre, le cassette dialisi può essere utilizzato come alternativa ai tubi di dialisi se lo si desidera. </li><li> Se del caso sulla base di linee guida del produttore, immergere il tubo dialisi taglio in acqua per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Riempire un serbatoio di dialisi (1 bicchiere L è stato utilizzato in questo video) con l'acqua (dialisato). Il volume dialisato dovrebbe essere di circa 100 volte quella del campione. </li><li> Piegare un'estremità del tubo due volte e fissare la parte piegata del tubo con una fascetta di chiusura dialisi. Avvolgere la fine della chiusura con un elastico per garantire che rimanga chiuso durante la dialisi. </li><li> Filtrare la miscela di reazione attraverso un filtro 0,2 micron, e caricare il filtrato nella parte aperta del tubo facendo attenzione a non strappare il tubo. Assicurarsi di lasciare sufficiente spazio testa per chiudere il tubo. </li><li> Piegare l'altra estremità aperta del tubo due volte, sicuro con una chiusura, e avvolgere la chiusura con un elastico come al punto 3.4. </li><li> Collegare un flaconcino di vetro contenente aria al morsetto su una delle estremità del tubo dialisi con un elastico. Fissare un flacone contenente sabbia per l'altro morsetto. Queste fiale in modo che il tubo rimane immerso nel dializzato. </li><li> Posizionare il tubo pieno nel serbatoio che contiene dialisi dialisi. </li><li> Mescolare il dializzato utilizzando una piastra magnetica mescolare a bassa velocità (non vortex) a temperatura ambiente. </li><li> Modificare il dialisato 3x nel corso di una giornata (in questo video, il dialisato è stato cambiato a 2,5, 6,5, e 11,5 ore), e quindi consentire di continuare la dialisi durante la notte (per un totale di 20-28 ore di dialisi). </li><li> Rimuovere il tubo di dialisi dal dialisato e attentamente aprire una chiusura a rimuovere l'esempio. Lavare il circuito di dialisi 3x con acqua e combinare i lavaggi con il campione. </li><li> Rimuovere l'acqua a pressione ridotta. Liofilizzazione è utilizzato in questo video. </li></ol> 4. Valutazione della presenza di metallo libero <ol><li> Sciogliere il complesso metallico a tampone (buffer di preparazione: Sciogliere 1,4 ml di acido acetico in 400 mL di acqua, aggiustare il pH a 5,8 con 1 M NH 4 OH, e aggiungere acqua per produrre un volume totale di 500 mL) e aggiungere il xilenolo Indicatore arancione (16 mM in tampone pH 5,8). In questo video, 0,3 mg di complesso è stato sciolto in 0,3 ml di buffer e 3 ml di soluzione d'indicatore è stato aggiunto. </li><li>Rilevare la presenza di metallo libero attraverso l'osservazione di un cambiamento di colore dell'indicatore dal giallo al viola. </li><li> Se lo si desidera, la quantità di metallo libero può essere quantificata mediante la creazione di una curva di calibrazione 1. In alternativa, il colorante arsenazo III può essere usato al posto di xilenolo arancio 2. Se il metallo libero rimane, il campione deve essere ulteriormente purificato tramite dialisi, una colonna di dissalazione, o ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) prima caratterizzazione. </li></ol> 5. Determinazione di acqua coordinamento numero (q) <ol><li> Preparare una soluzione del Eu III contenenti complesso (~ 1 mm) in H 2 O e un'altra soluzione della stessa concentrazione in D 2 O. Prima dell'analisi, la soluzione D 2 O devono essere evaporata e sciolto in D 2 O tre volte per rimuovere residui di H 2 O. </li><li> Aggiungere la soluzione di acqua ad una cuvetta pulita, e posizionare la cuvetta in una spettrofluorimetro. </li><li> Eseguire scansioni di eccitazione ed emissione per determinare i massimali previsti per ogni (~ ~ 395 nm e 595 nm, rispettivamente). </li><li> Eseguire una fosforescenza tempo di decadimento esperimento utilizzando i seguenti parametri: lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione stabiliti a partire dal punto 5.3, eccitazione e fenditure emissione (5 nm), flash contano (100), ritardo iniziale (0,01 ms), ritardo massimo (13 ms) e incremento di ritardo (0,1 ms). Queste condizioni sono adatte alla maggior parte dei complessi, ma il ritardo massimo e valori di incremento può essere aumentata o diminuita per le specie con tempi di decadimento molto lunghi o molto corti. </li><li> Ripetere il passo 5,4 con la soluzione di D 2 O preparato al punto 5.1. </li><li> Dal luminescenza-decadimento dati ottenuti in 5.4 e 5.5, la trama il logaritmo naturale di intensità in funzione del tempo. La pendenza di queste linee sono i tassi di decadimento (τ -1) (Figura 2). In questo video, Microsoft Excel 2007 è stato utilizzato per generare le trame logaritmo naturale dai dati grezzi. Utilizzare i tassi di decadimento nella equazione sviluppata da Horrocks e collaboratori (eq 1) 3. Se il legante contiene gruppi OH o NH coordinati al metallo, allora l'equazione deve essere modificata prima dell'uso 3. </li></ol> eq 1: <img src="/files/ftp_upload/2844/2844eq1.jpg" alt="Equazione 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 1"> 6. Relassività misure <ol><li> Selezionare la modalità di applicazione desiderata sull'analizzatore tempo di rilassamento: T 1 (tempo di rilassamento longitudinale) o T 2 (tempo di rilassamento trasversale). </li><li> Preparare una serie di campioni che contengono diverse concentrazioni di Gd III contenenti complessi in un solvente acquoso. In questo video, l'acqua è stato utilizzato come solvente e soluzioni di 10.0, 5.00, 2,50, 1,25, 0,625 e 0 mm sono stati preparati. Altri solventi acquosi o buffer potrebbe essere usato, ma è importante utilizzare il solvente come il vuoto. Il volume finale del campione è specifico per lo strumento che viene utilizzato. </li><li> Porre un campione nello strumento e lasciare riposare per 5 minuti per equilibrare la temperatura dello strumento (37 ° C in questo video). </li><li> Determinare il tempo di rilassamento (in unità di s) regolando i parametri del software per ottenere una curva esponenziale per T 1 o T 2 (curve rappresentante per T 1 e T 2 sono mostrati in Figura 3). </li><li> Ripetere i passi 6.3 e 6.4 per tutti i campioni compreso il bianco. </li><li> Calcolare l'inverso della misurato T 1 o T 2 valori in unità di s -1. </li><li> Tracciare la T o T 1 -1 2 -1 valori in funzione della concentrazione Gd III (in unità di mM). A causa della natura igroscopica di Gd III contenenti complessi, confermare la concentrazione di Gd III con spettrofotometria ad assorbimento atomico o spettrometria di massa ad accoppiamento induttivo plasma. Montare la trama con una linea retta. Un diagramma rappresentante è mostrata in Figura 4. </li><li> La pendenza della retta è la relassività (r 1 e r 2 per T 1 e T 2, rispettivamente) ed ha unità di mM -1 s -1. </li></ol> 7. Rappresentante Risultati Dati rappresentativi per i passaggi di questo protocollo sono stati inseriti nelle tabelle e figure sezione. Oltre all'acqua coordinamento numero e la caratterizzazione relassività descritte nel protocollo, è importante per caratterizzare prodotti finali utilizzando tecniche chimiche standard. L'identità del composto può essere ottenuto utilizzando la spettrometria di massa, spettri di massa e di rappresentanza che mostra i modelli isotopo diagnostici per Gd III - III e Eu contenenti complessi sono mostrati in figura 5. Inoltre, per i non-Gd III <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Schema generale per metalation e purificazione:. Schema raffigurante la procedura generale per metalation e le ragioni per la scelta di percorsi diversi purificazione. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 luminescenza intensità trama:. Trama Rappresentante del logaritmo naturale di intensità in funzione del tempo dalla sezione 5. Le pendenze delle linee generate da curve simili acquisiti per l'acqua e le soluzioni D 2 O vengono usati con eq 1 a caratterizzare l'acqua coordinamento numero di Eu III contenenti complessi. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 curve di rilassamento tempo di decadimento:. Dati Rappresentante per (a sinistra) T 1 e (a destra) T 2 acquisizione. Deviazioni da queste forme curva dovrebbe produrre dati inattendibili. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 determinazione relassività:. Un grafico rappresentativo di 1 / T 1 contro la concentrazione di Gd III. La pendenza della retta è relassività e dispone di unità di mM -1 s -1. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5 spettri di massa:. Spettri di massa rappresentante che mostra i modelli diagnostici per isotopo (a sinistra) Gd III contenenti complessi e (a destra) Eu III contenenti complessi. I picchi neri rappresentano la distribuzione gaussiana teorica isotopo e le linee rosse sono i dati effettivi.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Dato il numero crescente di pubblicazioni che includono lantanidi a base di agenti di contrasto 4-14, è importante che la cura nella preparazione, purificazione e caratterizzazione dei prodotti per garantire risultati riproducibili e comparabili. Questi complessi sono spesso considerati difficili da purificare e caratterizzare rispetto alle molecole organiche a causa della loro natura paramagnetica e la sensibilità di gruppi funzionali che potrebbero essere utilizzati per bioconjugation. Abbiamo descritto i m...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagenti e attrezzature </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> EuCl 3 • 6H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203254-5G </td></tr><tr><td> p-SCN-Bn-DTPA </td><td> Macrocyclics </td><td> B-305 </td></tr><tr><td> idrossido di ammonio </td><td> EMD </td><td> AX1303-3 </td></tr><tr><td> Spectra / Por Biotech Cellulosa Ester (CE) membrana di dialisi - 500 D MWCO </td><td> Fisher Scientific </td><td> 68-671-24 </td></tr><tr><td> Millipore IC Millex-LG Filtro Unità </td><td> Fisher Scientific </td><td> SLLG C13 NL </td></tr><tr><td> xilenolo arancione sale tetrasodico </td><td> Alfa Aesar </td><td> 41379 </td></tr><tr><td> acido acetico </td><td> Fluka </td><td> 49199 </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Cambridge Isotope Laboratories, Inc. </td><td> DLM-4-25 </td></tr><tr><td> purificatore d&#39;acqua </td><td> ELGA </td><td> Purelab Ultra </td></tr><tr><td> cromatografia liquida ad alta prestazione e la spettrometria di massa </td><td> Shimadzu </td><td> LCMS-2010EV </td></tr><tr><td> tempo di rilassamento analizzatore </td><td> Bruker </td><td> mq60 minispec </td></tr><tr><td> Spettrofotometro UV-vis </td><td> Fisher Scientific </td><td> 20-624-00092 </td></tr><tr><td> congelare asciugatrice </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-030-133 </td></tr><tr><td> pH-metro </td><td> Hanna Instruments </td><td> HI 221 </td></tr><tr><td> spettrofluorimetro </td><td> HORIBA Jobin Yvon </td><td> Fluoromax-4 </td></tr><tr><td> Molecular Weight Calculator versione 6,46 da Matthew Monroe, scaricato 17 Ottobre 2009 </td><td> <a href="http://ncrr.pnl.gov/software/">http://ncrr.pnl.gov/software/</a> </td><td> Peso Molecolare Calculator </td></tr></tbody></table>

preparazione, purificazione e caratterizzazione di complessi lantanidi per l&#39;uso di agenti di contrasto per risonanza magnetica

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Polyaminopolycarboxylate a base di leganti sono comunemente utilizzati per chelare ioni lantanidi, ed i complessi risultanti sono utili come agenti di contrasto per risonanza magnetica (MRI). Molti ligandi disponibili in commercio sono particolarmente utili perché contengono gruppi funzionali che consentono veloci, elevata purezza e ad alto rendimento coniugazione a macromolecole e biomolecole attraverso esteri attivati ​​ammina-reattiva e gruppi isotiocianato o tiolo-reattiva maleimides. Mentre metalation di questi ligandi è considerato conoscenza comune nel campo della chimica bioconjugation, sottili differenze nelle procedure metalation devono essere presi in considerazione nella scelta dei materiali metallici di partenza. Inoltre, più opzioni per la purificazione e la caratterizzazione esistono, e la scelta della procedura più efficace dipende in parte dalla selezione delle materie prime. Queste sottili differenze sono spesso trascurati nei protocolli pubblicati. Qui, il nostro obiettivo è quello di dimostrare metodi comuni per metalation, purificazione e caratterizzazione di complessi di lantanidi, che possono essere usati come agenti di contrasto per risonanza magnetica (Figura 1). Ci aspettiamo che questa pubblicazione permetteranno agli scienziati biomedici di incorporare le reazioni di complessazione lantanidi nel loro repertorio di reazioni comunemente usate dai facilitando la selezione delle materie prime e metodi di purificazione.

Dimostriamo la metalation, purificazione e caratterizzazione di complessi di lantanidi. I complessi qui descritto può essere coniugato con macromolecole di attivare il rilevamento di queste molecole usando la risonanza magnetica.

Preparazione, purificazione e caratterizzazione di complessi lantanidi per l&#39;uso di agenti di contrasto per Risonanza Magnetica

I ligandi a base di poliammino-policarbossilato sono comunemente utilizzati per chelare gli ioni lantanidi, e i complessi risultanti sono utili come agenti di contrasto per...

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare, purificare e caratterizzare complessi contenenti lantanidi che possono essere utilizzati per etichettare macromolecole biologiche. Questo risultato si ottiene innanzitutto mescolando il materiale di partenza metallico e il ligando, controllando al contempo il pH della soluzione. Il secondo passaggio della procedura consiste nel purificare il complesso ottenuto mediante dialisi.Successivamente, è necessario verificare l'assenza di metallo libero. L'ultimo passaggio della procedura consiste nella caratterizzazione delle proprietà del complesso rilevanti per l'imaging. In definitiva, è possibile ottenere risultati che dimostrano come i complessi sintetizzati si comportino come agenti di contrasto mediante misurazioni dell'attività di rilassamento.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'imaging, ad esempio se il numero di coordinazione dell'acqua di un agente di contrasto cambia al legame con una proteina. In generale, chi necessita di questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché non controllare con attenzione il pH renderebbe l'LI inutile per l'educazione in ambito biologico. La d

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In questo video, ci mostra come etichetta cellule staminali embrionali umane (hESC) con cloruro di manganese...

Etichettatura in vitro di cellule staminali embrionali umane per la Risonanza Magnetica

Tregs sono potenti soppressori del sistema immunitario. Vi è una mancanza di marcatori di superficie unica per definire loro, quindi, le definizioni di Tregs sono soprattutto funzionali. Qui descrivere un...

Umano In Vitro</emSoppressione> come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

Per dimostrare imaging molecolare del cancro RM con un piccolo peptide mirato MRI mezzo di contrasto specifico alle proteine ​​plasmatiche coagulato in stroma tumorale in un modello di cancro alla prostata del mouse.

MR Imaging Molecolare del cancro alla prostata con un piccolo Molecular CLT1 Peptide mirato di contrasto agente

Questo protocollo descrive la sintesi di nanoparticelle blu di Prussia biofunzionalizzate e il loro utilizzo come agenti di imaging molecolare multimodale. Le nanoparticelle hanno un design core-shell in cui gli ioni gadolinio o manganese all'interno del nucleo della nanoparticella generano un contrasto MRI. L'involucro biofunzionale contiene fluorofori per l'imaging a fluorescenza e ligandi di targeting per il targeting molecolare.

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticelle per applicazioni di imaging multimodale molecolari

Questo protocollo descrive la preparazione e caratterizzazione di un agente di contrasto dendrimerica risonanza magnetica (MRI) che porta chelati macrociclici cyclen basati coordinamento ioni paramagnetici gadolinio. In una serie di esperimenti in vitro MRI, questo agente prodotto un segnale RM amplificato rispetto all'analogo monomerica disponibile in commercio.

Preparazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caratterizzazione del dendrimero a base di agenti di contrasto per risonanza magnetica

Qui, descriviamo un protocollo per la radiomarcatura e il test in vivo di derivati tridentati 99mTc(I) chelato-tetrazina per il pre-targeting e la chimica bioortogonale.

Preparazione e valutazione di<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc marcato tridentate chelati di pre-targeting Utilizzando Bioorthogonal Chimica

Viene descritto l'uso di molecole di polideossinucleotide (aptamero 44-mer) per rilevare lo ione gadolinio (III) non chelato in una soluzione acquosa. La presenza dello ione viene rilevata tramite un aumento dell'emissione di fluorescenza del sensore.

Un sensore Aptamero-based per Unchelated gadolinio (III)

Un protocollo è presentato per la sintesi di nanocristalli core-shell drogato con lantanidi upconversion (UCNs) e le loro applicazioni cellulare per regolazione della proteina canale su illuminazione a luce vicina all'infrarosso (NIR).

Sintesi di nanocristalli di Upconversion drogato con lantanidi Core-shell per applicazioni cellulari

Procedure di fabbricazione per lo ione altamente magneticamente reattivo dei lantanidi chelanti polimolecolari assembly sono presentate. La risposta magnetica è dettata dalle dimensioni di montaggio, che sono su misura per estrusione attraverso membrane nanopore. Alignability magnetica indotta da temperatura cambiamenti strutturali e le assemblee sono monitorati da misurazioni di birifrangenza, una tecnica gratuita per risonanza magnetica nucleare e lo scattering di neutroni piccolo angolo.

Procedure di fabbricazione e birifrangenza misurazioni per la progettazione di ioni lantanidi magneticamente reattivo chelanti del fosfolipide assembly

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere68Ga ossido drogato con nucleo di ferro via veloce a microonde-driven sintesi di nanoparticelle. La metodologia rende PET / (T1) MRI nanoparticelle con efficienza superiore al 90% e purezza radiochimica del 99% in una sintesi di 20 min di radiolabeling.

Sintesi di nanoparticelle Core-drogati di ossido di ferro di 68Ga per Dual tomografia a emissione di positroni/Imaging di risonanza magnetica (T1)

Impara a sintetizzare, purificare e caratterizzare complessi di lantanidi per l'imaging biologico mediante risonanza magnetica. Questo metodo consente di marcare macromolecole con agenti di contrasto purificati.

Preparazione, purificazione e caratterizzazione di complessi lantanidi per l'uso di agenti di contrasto per Risonanza Magnetica

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