Preparazione, purificazione e caratterizzazione di complessi lantanidi per l'uso di agenti di contrasto per Risonanza Magnetica

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare, purificare e caratterizzare complessi contenenti lantanidi che possono essere utilizzati per marcare macromolecole biologiche. Ciò si ottiene mescolando prima il materiale di partenza in metallo e il ligando, controllando il pH della soluzione. Il secondo passo della procedura consiste nel purificare il complesso risultante utilizzando la dialisi.

Successivamente, è necessario verificare l'assenza di metallo libero. La fase finale della procedura è la caratterizzazione delle proprietà del complesso che sono rilevanti per l'imaging. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano che i complessi sintetizzati si comporteranno come agenti di contrasto attraverso misurazioni dell'attività di rilassamento.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'imaging, ad esempio se il numero di coordinazione dell'acqua di un agente di contrasto cambia quando si lega a una proteina. In generale, le persone che hanno bisogno di questo metodo avranno difficoltà perché il controllo netto e attento del pH risulterà nel rendere il LI e inutile per l'educazione biologica. A dimostrare la dialisi e le misurazioni dell'attività saranno Buda e Sashi.

Studenti laureati del mio laboratorio Per iniziare la metazione usando i sali di lantanidi, prima dissolvo un equivalente di ligando in acqua per produrre una soluzione da 30 a 265 millimolari. Il legante Paraiso Benzyl DTPA viene utilizzato qui ad una concentrazione di 73 Millimolare. Quindi, regolare il pH della soluzione del legante tra 5,5 e sette aggiungendo un idrossido di ammonio molare.

In questo video, 0,2 millilitri della soluzione di idrossido di ammonio di un molare vengono utilizzati ora per sciogliere uno o due equivalenti di cloruro di lantanide in acqua per produrre una soluzione con una concentrazione da cinque a 1000 millimolari. Sia il cloruro di bio europeo che il cloruro di gadolinio possono essere utilizzati in concentrazioni di 111 millimolari. Spesso un eccesso di metallo viene utilizzato per portare a termine la ventilazione e di conseguenza semplificare la depurazione.

Quindi, aggiungere ciascuna soluzione di sali di Lathan alla soluzione preparata di ligando mescolando. Ora regolare il pH delle miscele di reazione risultanti tra 5,5 e sette aggiungendo idrossido di ammonio 0,2 molare. Qui, un totale di 0,5 millilitri della soluzione di idrossido di ammonio 0,2 molare viene utilizzato per regolare la soluzione.

Se il ligando utilizzato contiene gruppi funzionali sensibili agli acidi, regolare il pH più volte durante questo passaggio. Assicurarsi di prestare attenzione quando si regola il pH perché se la soluzione diventa troppo basica, qualsiasi gruppo funzionale sensibile alle basi come l'isotiocianato sarà reso inutilizzabile. Per la coniugazione, monitorare attentamente la reazione tramite misure di pH.

La reazione è completa quando il pH rimane costante Per i ligandi senza gruppi funzionali sensibili alle basi, può essere utile anche un workup che comporti l'aumento del pH. Per iniziare l'iter di dialisi, determinare una lunghezza appropriata del tubo di dialisi per contenere il volume del campione più una lunghezza extra per contenere un ulteriore 10% del volume del campione. Quindi seguire le linee guida del produttore per tagliare il tubo a questa lunghezza.

In questo video è stata utilizzata una membrana di taglio del peso molecolare da 100 a 500 Dalton, ma è possibile utilizzare un tubo di taglio del peso molecolare più grande, se necessario, se la coniugazione viene eseguita prima della metazione, se appropriato, in base alle linee guida del produttore, immergere il tubo di dialisi tagliato e immergere per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, riempi un serbatoio di dialisi con acqua, che fungerà da dializzato. Qui viene utilizzato un becher da un litro.

Il volume del dialisato deve essere circa 100 volte quello del campione. Ora piega due volte un'estremità del tubo e fissa la parte piegata con il morsetto di chiusura della dialisi. Avvolgere l'estremità della chiusura con un elastico per assicurarsi che rimanga chiusa durante la dialisi.

Filtrare la miscela di reazione precedentemente preparata attraverso un filtro da 0,2 micron. Quindi caricare il filtrato nell'estremità aperta del tubo. Fare attenzione a non strappare il tubo.

Assicurarsi di lasciare abbastanza spazio per la testa per chiudere il tubo. Piegare due volte l'estremità aperta rimanente del tubo, quindi fissarla con una chiusura e avvolgere la chiusura con un elastico. Quindi, collegare una fiala di vetro contenente aria al morsetto su un'estremità del tubo di dialisi utilizzando un altro elastico.

Quindi attaccare una fiala contenente sabbia all'altro morsetto. Queste fiale assicurano che il tubo rimanga immerso nel dializzato. Ora, posiziona il tubo pieno nel serbatoio di dialisi che contiene dializzato.

Mescolare il dialisato utilizzando una piastra di agitazione magnetica a bassa velocità a temperatura ambiente. Assicurarsi che la velocità di agitazione rimanga lenta e che la soluzione no. Vortice. Cambia il dialate tre volte nel corso di una giornata.

In questo video, la composizione viene modificata a 2,5, 6,5 e 11,5 ore. Lasciare che la dialisi continui durante la notte per un totale di 20-28 ore. Una volta completata la dialisi, rimuovere il tubo dal dialato e aprire con cautela una chiusura per rimuovere il campione.

Lavare il tubo per dialisi tre volte con acqua e combinare i lavaggi con il campione. Infine, rimuovere l'acqua dal campione a pressione ridotta. Ciò si ottiene mediante liofilizzazione.

Il campione viene congelato e quindi posto su un apparecchio di liofilizzazione. Per valutare la presenza di metallo libero nel campione, preparare prima il tampone acetato sciogliendo 1,4 millilitri di acido acetico in 400 millilitri di acqua, regolare il pH a 5,8 con un idrossido di ammonio molare e aggiungere acqua per produrre un volume totale di 500 millilitri. Quindi sciogliere 0,3 milligrammi di ciascun complesso in 0,3 millilitri di tampone.

Ora prepara l'indicatore xol orange, che dovrebbe essere 16 micromolare nel tampone pH 5.8. Aggiungere tre millilitri di questa soluzione indicatrice ai complessi metallici precedentemente disciolti. Rileva la presenza di metallo libero attraverso l'osservazione di un cambiamento di colore dell'indicatore da giallo a viola.

Se lo si desidera, la quantità di metallo libero può essere quantificata creando una curva di calibrazione. Se rimane del metallo libero, il campione deve essere ulteriormente purificato mediante dialisi o cromatografia liquida ad alta prestazione prima della caratterizzazione. Successivamente, per determinare il numero di coordinazione dell'acqua per un campione di oppio, preparare una soluzione di circa un millimolare del complesso contenente oppio in acqua, e poi un'altra soluzione della stessa concentrazione in ossido di deuterio.

Prima dell'analisi, la soluzione di ossido di deuterio deve essere evaporata e disciolta in ossido di deuterio tre volte per rimuovere l'acqua residua, accendere lo spettrofluorimetro, aggiungere la soluzione acquosa a un vete pulito e posizionare il vete nello spettrofluorimetro. Ora esegui l'eccitazione e le emissioni per determinare i massimi per ciascuno a circa 395 nanometri, 595 nanometri rispettivamente. Successivamente, eseguire un esperimento di decadimento del tempo di fosforescenza utilizzando le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione appena determinate e i parametri visualizzati qui.

Ripetere questo passaggio con una soluzione di ossido di deuterio preparata dal grafico dei dati di decadimento della luminescenza appena ottenuto, il logaritmo naturale dell'intensità rispetto al tempo. La pendenza di queste linee sono i tassi di decadimento. In questo video, Microsoft Excel 2007 è stato utilizzato per generare i grafici log naturali dai dati grezzi.

Usa i tassi di decadimento nell'equazione sviluppata da hors e colleghi visti qui. Se il ligando contiene gruppi OH o NH coordinati al metallo, l'equazione deve essere modificata prima dell'uso. Per determinare prima le misure di relatività del campione, selezionare la modalità di applicazione desiderata sull'analizzatore del tempo di rilassamento, T uno o T due.

Qui è selezionata l'impostazione T one. Successivamente, preparare una serie di campioni che contengano diverse concentrazioni del complesso contenente lantanidi in un solvente acquiescente. Qui, l'acqua viene utilizzata come solvente e le soluzioni di dieci, cinque, due, 0,5, 1,25, 0,625 e zero.

I millimolari sono preparati. È possibile utilizzare altri solventi o tamponi acquiescenti, ma è importante utilizzare il solvente come grezzo. Il volume finale del campione è specifico per lo strumento che viene utilizzato.

Metti un campione nello strumento e lascialo riposare per cinque minuti per equilibrarlo alla temperatura dello strumento, che è di 37 gradi Celsius per l'unità utilizzata in questo video. Ora determina il tempo di rilassamento in unità di secondi regolando i parametri del software per ottenere una curva esponenziale regolare per T uno o T due. Ripetere l'operazione per tutti i campioni, compreso il pezzo grezzo.

Ora, calcola l'inverso dei valori di rilassamento T uno o T due misurati e traccia. Questi valori rispetto alla concentrazione di Lathan e alle unità di millimolari si adattano al grafico con una linea retta. La pendenza della linea montata è l'attività di rilassamento che è R uno o R due rispettivamente per T uno e T due.

Qui vediamo lo schema generale per la mediazione e la purificazione. Questo schema descrive la procedura generale per la metazione e le ragioni per la scelta di diverse radici di purificazione. Qui vediamo un grafico rappresentativo del decadimento della luminescenza in cui il log naturale del decadimento è tracciato rispetto al tempo, le pendenze delle linee generate da curve simili richieste per l'acqua e le soluzioni di ossido di deuterio sono utilizzate con l'equazione uno per determinare il numero di coordinazione dell'acqua dei complessi contenenti oppio.

Un esempio rappresentativo di misure di lività può essere visto qui con una pendenza della linea adattata che è la lività T uno del campione. Oltre al numero di coordinazione dell'acqua e alla caratterizzazione della vita descritti nel protocollo, è importante caratterizzare anche i prodotti finali utilizzando tecniche chimiche standard. L'identità del composto può essere ottenuta utilizzando la spettrometria di massa, spettri di massa rappresentativi che mostrano i modelli isotopici diagnostici per i complessi contenenti gadolinio e oppio.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la spettroscopia endr HPLC e l'analisi elementare per caratterizzare ulteriormente i complessi risultanti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare, purificare e caratterizzare complessi contenenti lantanidi che possono essere utilizzati per etichettare macromolecole biologiche.