Caratterizzazione delle cellule del tumore usando un filo medico per l'acquisizione di cellule tumorali circolanti: un approccio 3D basato sul DNA pesce e immunofluorescenza
December 21st, 2017
Vi presentiamo un nuovo approccio per caratterizzare le cellule del tumore. Abbiamo combinato l'immunofluorescenza con DNA fluorescentein situ-ibridazione per valutare cellule catturate da un filo medico funzionalizzato capace di in vivo arricchimento CTCs direttamente dal sangue del paziente.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di combinare la colorazione in immunofluorescenza con l'ibridazione in situ fluorescente del DNA su un filo funzionalizzato 3D e di identificare l'immunofenotipo e i segnali FISH sul supporto utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale a campo largo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della caratterizzazione delle cellule tumorali, come l'identificazione di bersagli correlati alla terapia su cellule di carcinoma polmonare non a piccole cellule circolanti. Il vantaggio principale di questo protocollo è quello di consentire l'identificazione simultanea di parametri fenotipici come la positività per EpCAM e di alterazioni citosomatiche come lo stato del gene ARC per rilevare CTC putative.
Sebbene questo metodo sia stato progettato in modo univoco per fornire le caratteristiche CTC del cancro all'insulina in situ, può essere applicato anche allo studio di altri tumori come il cancro al seno. Abbiamo sviluppato questo protocollo mentre maneggiavamo il filo per l'immunofenotipizzazione diretta e il rilevamento di CTC. Per ottenere più dati, abbiamo associato un protocollo di immunofenotipizzazione con un protocollo di ibridazione in situ a fluorescenza del DNA.
La manipolazione del filo non è facile, soprattutto perché la punta funzionalizzata è fragile. Una dimostrazione visiva vedrà i lettori riprodurre i passaggi. Per iniziare l'esperimento, risospendere l'intero contenuto di un pallone T75 che si trova all'80% di confluenza in una fiala da cinque millilitri utilizzando quattro millilitri di terreno completo.
Quindi, rimuovi il filo dalla sua confezione di vetro. Immergere la parte d'oro funzionalizzato del filo nella fiala, assicurandosi che il tappo del filo sia a tenuta stagna per una fiala da cinque millilitri. Sigillare il filo con pellicola da laboratorio.
Quindi, incubare il filo in un rotatore per provette per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo la rotazione, sciacquare il filo tre volte in una soluzione PBS utilizzando tre diverse fiale pulite e attendere che il filo si asciughi. Dopo aver asciugato il filo all'aria per 10 minuti in una cappa, fissare le celle immergendo il filo in una soluzione di acetone al 100% in un tubo da cinque millilitri per 10 minuti a temperatura ambiente.
Assicurarsi che non ci sia traccia di acetone sulla punta funzionalizzata. Asciugare il filo all'aria per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, in un tubo da cinque millilitri, lavare il filo due volte in una piega PBS.
Incubare il filo in un tampone di diluizione dell'anticorpo. Preparare 150 microlitri di miscela di anticorpi con una diluizione dell'anticorpo primario monoclonale coniugato con fluorocromo e tampone di diluizione dell'anticorpo specificato nella scheda tecnica. Quindi, utilizzare una punta P200 per estrarre il filo dal fermafilo e inserire delicatamente il filo attraverso il foro più grande della punta.
Inserisci prima l'estremità non funzionalizzata e tira lentamente il filo attraverso il foro più piccolo fino a quando la parte dorata non si trova appena oltre il foro più grande. Aggiungere delicatamente 150 microlitri della miscela di anticorpi nella punta. Per evitare il rischio di formazione di bolle, far roteare delicatamente il filo fino a quando l'estremità funzionalizzata non è completamente immersa.
Sigillare il foro della punta e avvolgere la pellicola da laboratorio attorno al foro. Incubare il filo verticalmente per una notte al buio a quattro gradi Celsius. Il secondo giorno, bloccare l'incubazione degli anticorpi lavando il filo due volte in PBS in una sola volta.
Reinserire il filo nel suo fermafilo. Tre ore prima del protocollo DNA-FISH, impostare il forno di ibridazione a 75 gradi Celsius e impostare il forno a calore secco a 37 gradi Celsius. Raffreddare la soluzione di SSC 0,4 volte a quattro gradi Celsius.
Lavare il filo tre volte in una soluzione di SSC 0,4 volte ghiacciata. Asciugare il filo al buio sotto la cappa aspirante per 10 minuti. Dopo 10 minuti, agitare e far girare la sonda per cinque secondi.
Far cadere 10 microlitri di sonda in microprovette di vetro, quindi coprirle con pellicola da laboratorio. Avvolgere le microprovette in carta assorbente asciutta. Mettetele in un tubo da 50 millilitri e giratele brevemente.
Posizionare con cautela il filo asciugato nel microtubo e inserire il fermafilo. Quindi, sigillare il fermafilo con cemento di gomma. Posizionare il filo in una camera umida e buia nel forno di ibridazione per otto minuti a 75 gradi Celsius per ottenere la completa denaturazione del DNA.
Dopo otto minuti, spostare la camera umida in un forno a calore secco a 37 gradi Celsius per una notte. Posizionare il barattolo di colorazione dei vetrini con una soluzione di SSC 0,4 volte in un bagnomaria impostato a 72 gradi Celsius. Controllare la temperatura della soluzione SSC 0,4 volte fino a raggiungere 72 gradi Celsius più o meno.
Quindi, prepara due bicchieri di vetro. Uno con SSC a due pieghe più soluzione Tween allo 0,05% e il secondo con acqua distillata. Rimuovere la camera umida per il forno a calore secco.
Usa una pinzetta per rimuovere con cura il cemento di gomma dal fermo del filo e tira l'estremità non rivestita del filo attraverso il tappo terminale, facendo attenzione a non danneggiare la punta funzionalizzata. Immergere il filo nella soluzione di SSC 0,4 volte per due minuti a 72 gradi Celsius. Lavare il filo in SSC a due pieghe più una soluzione di interpolazione allo 0,05% per 30 secondi a temperatura ambiente.
Quindi, lavare il filo in acqua distillata a temperatura ambiente. Asciugare il filo sotto la cappa aspirante per 10 minuti al buio. Incubare la punta funzionalizzata del filo con la soluzione DAPI precedentemente preparata in una fiala da due millilitri.
Sciacquare il filo due volte in PBS in una piega e asciugare il filo all'aria. Posizionare il filo nel portafilo e inserire con cautela la punta funzionalizzata attraverso il punto di ingresso dell'apposito supporto fino a quando la punta non corrisponde al punto di aggancio. Posizionare il supporto speciale sul tavolino del microscopio.
Regolare la messa a fuoco del microscopio utilizzando una lente da 20 pieghe. Per prima cosa, concentrati grossolanamente sul supporto speciale e poi regola finemente sulle celle che appaiono luminose nel canale DAPI. Focalizzare solo le celle al centro dell'obiettivo e acquisire immagini utilizzando una fotocamera digitale a 12 bit in obiettivi 20x e 40x con filtri appropriati per sonde rosse, verdi e blu.
Infine, preparare il filo per la conservazione a lungo termine imballando il filo accanto alla punta funzionalizzata e inserendo con cura il filo in un tubo di vetro. Conservare il filo verticalmente o orizzontalmente a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. La colorazione in immunofluorescenza non ha interferito con i segnali DNA-FISH.
Quando il test immuno-DNA-FISH è stato eseguito sul filo funzionalizzato con supporto 3D, la colorazione EpCam era chiaramente visibile. La sonda ALK ha rivelato la delezione del gene. La linea cellulare NCI-H3122 ha mostrato uno stato aberrante del gene LAK in contrasto con l'NCI-H1975 con un ALKG wild type.
Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere eseguito in nove ore lavorative totali in tre giorni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante non toccare la parte funzionalizzata del filo per evitare danni. Diversi anticorpi e sonde FISH possono essere utilizzati seguendo questo protocollo per rispondere a ulteriori domande, come l'identificazione di cellule con altri marcatori fenotipici e altre alterazioni citogenetiche come l'amplificazione del gene NAT o HAR2.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare simultaneamente CTC putative attraverso parametri fenotipici come la positività per EpCAM e rilevare alterazioni citogenetiche come lo stato del gene ARC. Non dimenticare che lavorare con l'acetone e il forno può essere estremamente pericoloso. Precauzioni come maneggiare l'acetone nel cappuccio e indossare guanti protettivi devono essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.
Panoramica
Questo studio introduce un nuovo metodo per caratterizzare le cellule tumorali integrando l'immunofluorescenza con l'ibridazione in situ fluorescente del DNA (FISH). L'approccio utilizza un filo medico funzionalizzato per arricchire direttamente le cellule tumorali circolanti (CTC) dal sangue del paziente, facilitando l'identificazione di importanti marcatori immunofenotipici e genetici.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Oncologia
- Biologia cellulare
- Metodi diagnostici
Contesto
- La caratterizzazione delle cellule tumorali circolanti è cruciale per la diagnosi e il trattamento del cancro.
- I metodi attuali spesso mancano della capacità di valutare simultaneamente più parametri.
- Questo studio mira a migliorare la rilevazione e l'analisi delle CTC nel carcinoma polmonare a cellule non piccole.
- Il protocollo può anche essere adattato per altri tipi di cancro, come il cancro al seno.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo che combini immunofluorescenza e DNA-FISH per la caratterizzazione delle CTC.
- Identificare obiettivi legati alla terapia sulle CTC.
- Migliorare la comprensione della biologia delle cellule tumorali attraverso l'analisi simultanea di caratteristiche fenotipiche e genetiche.
Metodi utilizzati
- Filo funzionalizzato per catturare le CTC dai campioni di sangue.
- Colorazione immunofluorescente per valutare l'immunofenotipo.
- DNA-FISH per analizzare le alterazioni genetiche.
- Microscopia per l'imaging e l'acquisizione dei dati.
Risultati principali
- Identificazione con successo di CTC con specifici marcatori immunofenotipici.
- Rilevazione di alterazioni genetiche associate alle caratteristiche del tumore.
- Fattibilità dimostrata del metodo per vari tipi di cancro.
- Il protocollo consente la riproducibilità e la facilità d'uso in ambienti di laboratorio.
Conclusioni
- Il metodo combinato di immunofluorescenza e DNA-FISH è efficace per la caratterizzazione delle CTC.
- Questo approccio può fornire informazioni sulla biologia del tumore e sui target di trattamento.
- Le applicazioni future potrebbero estendersi ad altre malignità oltre al cancro del polmone.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method addresses the critical challenge of rare circulating tumor cell (CTC) detection by enabling high-volume blood sampling and simultaneous phenotypic and genetic analysis. By integrating immunofluorescence and DNA FISH on a 3D functionalized wire, it provides a scalable approach for CTC enrichment and characterization directly from peripheral blood. The workflow supports early discovery efforts by delivering multiplexed data on cell surface markers and chromosomal alterations, informing target validation and patient stratification strategies in oncology drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic targets through simultaneous detection of EpCAM positivity and ALK gene translocation in captured CTCs.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking by correlating phenotypic markers with cytogenetic alterations in a single workflow.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing multiplexed data on putative CTCs for hypothesis-driven target validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by capturing CTCs from large blood volumes (1.5–3 L) via 30-minute wire incubation.
- Reproducibility: Standardizes CTC isolation and immuno-DNA FISH processing on a 3D support, enabling consistent phenotypic and genetic readouts.
- Quantitative Output: Generates measurable immunofluorescence and FISH signals detectable via conventional widefield fluorescence microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrated feasibility in NSCLC cell lines (NCI-H3122 and NCI-H1975) for EpCAM and ALK status, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking CTC phenotype to genotype in disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in CTC characterization by co-localizing protein expression and gene status on individual cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, offering a reusable capability for CTC analysis across oncology indications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling simultaneous phenotypic and genetic profiling of rare CTC populations.
- Screening: Delivers assay-ready CTC samples with standardized isolation and staining protocols for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative readouts (EpCAM intensity, ALK FISH signals) that allow comparative analysis across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through disease-relevant CTC characterization in NSCLC models.
- Enterprise Reuse: Functions as a platform technology adaptable to multiple cancer types (e.g., breast cancer) and diverse antibody/FISH probe combinations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in CTC biomarker studies by reducing mechanistic ambiguity through correlated phenotyping and genotyping.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability via a wire-based system compatible with conventional microscopy and standard reagents.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering multiparametric CTC data that inform target specificity and patient selection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on CTC phenotype-genotype concordance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, DNA FISH, and delicate handling of functionalized wire tips to prevent damage.
- Depends on access to a conventional widefield fluorescence microscope with appropriate filter sets for DAPI, FITC, and Cy3/Cy5 equivalents.
- Necessitates cross-team standardization of wire preparation, incubation, and imaging protocols to ensure reproducibility across sites.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to different cancer types or alternative phenotypic/genetic markers.
- Includes practical limitations such as the fragility of the wire’s functionalized tip and the need for hazardous material precautions (acetone, ovens).
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:34
Immuno-DNA FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) on Wire
2:35
Fixation, Permeabilization, and Immunofluorescence
4:25
3D DNA FISH Day 2
6:08
3D DNA FISH Day 3
7:51
3D Microscope Observation and Analysis
9:01
Results: No Interference Bewteen Immunofluorescence and DNA FISH Signals
9:38
Conclusion
