Caratterizzazione delle cellule del tumore usando un filo medico per l'acquisizione di cellule tumorali circolanti: un approccio 3D basato sul DNA pesce e immunofluorescenza

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di combinare la colorazione in immunofluorescenza con l'ibridazione in situ fluorescente del DNA su un filo funzionalizzato 3D e di identificare l'immunofenotipo e i segnali FISH sul supporto utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale a campo largo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della caratterizzazione delle cellule tumorali, come l'identificazione di bersagli correlati alla terapia su cellule di carcinoma polmonare non a piccole cellule circolanti. Il vantaggio principale di questo protocollo è quello di consentire l'identificazione simultanea di parametri fenotipici come la positività per EpCAM e di alterazioni citosomatiche come lo stato del gene ARC per rilevare CTC putative.

Sebbene questo metodo sia stato progettato in modo univoco per fornire le caratteristiche CTC del cancro all'insulina in situ, può essere applicato anche allo studio di altri tumori come il cancro al seno. Abbiamo sviluppato questo protocollo mentre maneggiavamo il filo per l'immunofenotipizzazione diretta e il rilevamento di CTC. Per ottenere più dati, abbiamo associato un protocollo di immunofenotipizzazione con un protocollo di ibridazione in situ a fluorescenza del DNA.

La manipolazione del filo non è facile, soprattutto perché la punta funzionalizzata è fragile. Una dimostrazione visiva vedrà i lettori riprodurre i passaggi. Per iniziare l'esperimento, risospendere l'intero contenuto di un pallone T75 che si trova all'80% di confluenza in una fiala da cinque millilitri utilizzando quattro millilitri di terreno completo.

Quindi, rimuovi il filo dalla sua confezione di vetro. Immergere la parte d'oro funzionalizzato del filo nella fiala, assicurandosi che il tappo del filo sia a tenuta stagna per una fiala da cinque millilitri. Sigillare il filo con pellicola da laboratorio.

Quindi, incubare il filo in un rotatore per provette per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo la rotazione, sciacquare il filo tre volte in una soluzione PBS utilizzando tre diverse fiale pulite e attendere che il filo si asciughi. Dopo aver asciugato il filo all'aria per 10 minuti in una cappa, fissare le celle immergendo il filo in una soluzione di acetone al 100% in un tubo da cinque millilitri per 10 minuti a temperatura ambiente.

Assicurarsi che non ci sia traccia di acetone sulla punta funzionalizzata. Asciugare il filo all'aria per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, in un tubo da cinque millilitri, lavare il filo due volte in una piega PBS.

Incubare il filo in un tampone di diluizione dell'anticorpo. Preparare 150 microlitri di miscela di anticorpi con una diluizione dell'anticorpo primario monoclonale coniugato con fluorocromo e tampone di diluizione dell'anticorpo specificato nella scheda tecnica. Quindi, utilizzare una punta P200 per estrarre il filo dal fermafilo e inserire delicatamente il filo attraverso il foro più grande della punta.

Inserisci prima l'estremità non funzionalizzata e tira lentamente il filo attraverso il foro più piccolo fino a quando la parte dorata non si trova appena oltre il foro più grande. Aggiungere delicatamente 150 microlitri della miscela di anticorpi nella punta. Per evitare il rischio di formazione di bolle, far roteare delicatamente il filo fino a quando l'estremità funzionalizzata non è completamente immersa.

Sigillare il foro della punta e avvolgere la pellicola da laboratorio attorno al foro. Incubare il filo verticalmente per una notte al buio a quattro gradi Celsius. Il secondo giorno, bloccare l'incubazione degli anticorpi lavando il filo due volte in PBS in una sola volta.

Reinserire il filo nel suo fermafilo. Tre ore prima del protocollo DNA-FISH, impostare il forno di ibridazione a 75 gradi Celsius e impostare il forno a calore secco a 37 gradi Celsius. Raffreddare la soluzione di SSC 0,4 volte a quattro gradi Celsius.

Lavare il filo tre volte in una soluzione di SSC 0,4 volte ghiacciata. Asciugare il filo al buio sotto la cappa aspirante per 10 minuti. Dopo 10 minuti, agitare e far girare la sonda per cinque secondi.

Far cadere 10 microlitri di sonda in microprovette di vetro, quindi coprirle con pellicola da laboratorio. Avvolgere le microprovette in carta assorbente asciutta. Mettetele in un tubo da 50 millilitri e giratele brevemente.

Posizionare con cautela il filo asciugato nel microtubo e inserire il fermafilo. Quindi, sigillare il fermafilo con cemento di gomma. Posizionare il filo in una camera umida e buia nel forno di ibridazione per otto minuti a 75 gradi Celsius per ottenere la completa denaturazione del DNA.

Dopo otto minuti, spostare la camera umida in un forno a calore secco a 37 gradi Celsius per una notte. Posizionare il barattolo di colorazione dei vetrini con una soluzione di SSC 0,4 volte in un bagnomaria impostato a 72 gradi Celsius. Controllare la temperatura della soluzione SSC 0,4 volte fino a raggiungere 72 gradi Celsius più o meno.

Quindi, prepara due bicchieri di vetro. Uno con SSC a due pieghe più soluzione Tween allo 0,05% e il secondo con acqua distillata. Rimuovere la camera umida per il forno a calore secco.

Usa una pinzetta per rimuovere con cura il cemento di gomma dal fermo del filo e tira l'estremità non rivestita del filo attraverso il tappo terminale, facendo attenzione a non danneggiare la punta funzionalizzata. Immergere il filo nella soluzione di SSC 0,4 volte per due minuti a 72 gradi Celsius. Lavare il filo in SSC a due pieghe più una soluzione di interpolazione allo 0,05% per 30 secondi a temperatura ambiente.

Quindi, lavare il filo in acqua distillata a temperatura ambiente. Asciugare il filo sotto la cappa aspirante per 10 minuti al buio. Incubare la punta funzionalizzata del filo con la soluzione DAPI precedentemente preparata in una fiala da due millilitri.

Sciacquare il filo due volte in PBS in una piega e asciugare il filo all'aria. Posizionare il filo nel portafilo e inserire con cautela la punta funzionalizzata attraverso il punto di ingresso dell'apposito supporto fino a quando la punta non corrisponde al punto di aggancio. Posizionare il supporto speciale sul tavolino del microscopio.

Regolare la messa a fuoco del microscopio utilizzando una lente da 20 pieghe. Per prima cosa, concentrati grossolanamente sul supporto speciale e poi regola finemente sulle celle che appaiono luminose nel canale DAPI. Focalizzare solo le celle al centro dell'obiettivo e acquisire immagini utilizzando una fotocamera digitale a 12 bit in obiettivi 20x e 40x con filtri appropriati per sonde rosse, verdi e blu.

Infine, preparare il filo per la conservazione a lungo termine imballando il filo accanto alla punta funzionalizzata e inserendo con cura il filo in un tubo di vetro. Conservare il filo verticalmente o orizzontalmente a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. La colorazione in immunofluorescenza non ha interferito con i segnali DNA-FISH.

Quando il test immuno-DNA-FISH è stato eseguito sul filo funzionalizzato con supporto 3D, la colorazione EpCam era chiaramente visibile. La sonda ALK ha rivelato la delezione del gene. La linea cellulare NCI-H3122 ha mostrato uno stato aberrante del gene LAK in contrasto con l'NCI-H1975 con un ALKG wild type.

Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere eseguito in nove ore lavorative totali in tre giorni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante non toccare la parte funzionalizzata del filo per evitare danni. Diversi anticorpi e sonde FISH possono essere utilizzati seguendo questo protocollo per rispondere a ulteriori domande, come l'identificazione di cellule con altri marcatori fenotipici e altre alterazioni citogenetiche come l'amplificazione del gene NAT o HAR2.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare simultaneamente CTC putative attraverso parametri fenotipici come la positività per EpCAM e rilevare alterazioni citogenetiche come lo stato del gene ARC. Non dimenticare che lavorare con l'acetone e il forno può essere estremamente pericoloso. Precauzioni come maneggiare l'acetone nel cappuccio e indossare guanti protettivi devono essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.