Targeting Alpha Synuclein Aggregati in cutaneous periferici nervose fibre nervose da Pro(Enunciante autofluorescenza libera)

La diagnosi del morbo di Parkinson si basa ancora su segni clinici di coinvolgimento motorio che compaiono più avanti nel corso della malattia, quando la maggior parte dei neuroni della substantia nigra sono già persi. Questo protocollo consente l'analisi dei nervi dermici mediante biopsia cutanea, che rappresenta un potenziale nuovo biomarcatore della malattia, da utilizzare negli studi clinici. La biopsia cutanea è una procedura facilmente valutabile e non invasiva che consente l'analisi del tessuto nervoso periferico soggetto alla patologia.

Il rilevamento degli aggregati di alfa sinuleina mediante biopsia cutanea può essere utilizzato per scopi diagnostici, possibilmente nelle fasi iniziali, quando la potenziale cura è più efficace. Le biopsie cutanee di follow-up nello stesso paziente consentono un'analisi del tempo e del decorso speciale della diffusione dell'aggregato di alfa sinuleina nel sistema nervoso cutaneo umano. Questi possono far luce sulla patogenesi della malattia.

Per iniziare questa procedura, preparare una nuova soluzione fissante PLP come descritto nella tabella Uno del protocollo di testo. Immediatamente dopo aver raccolto la biopsia cutanea, immergerla in un tubo contenente 10 millilitri della soluzione fissante. Incubare durante la notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno dopo, in una cappa aspirante, rimuovere delicatamente il fissatore PLP. Nello stesso tubo, lavare la biopsia tre volte per cinque minuti ciascuna, utilizzando cinque millilitri della soluzione molare di Sorensen 0,1 per ogni lavaggio. Scartare la soluzione di Sorensen e aggiungere cinque millilitri di soluzione crioprotettiva.

Incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo, conservare la biopsia a quattro gradi Celsius se il taglio con un criotoma deve essere eseguito entro una settimana. Per prima cosa, imposta il criotomo su meno 20 gradi Celsius.

Prendi un criomold e riempilo con un mezzo crio-incorporante. Utilizzando le pinzette, immergere la biopsia nel mezzo crio-incorporante, con l'asse longitudinale parallelo al fondo del criomold. Snap congelare il campione con azoto liquido, per ottenere un cubo solido di mezzo crio-incorporante contenente la biopsia nel giusto orientamento.

Mettere il campione nel criostato e attendere 30 minuti per consentire alla biopsia di acclimatarsi. Quindi, fissare il campione sul criostato e tagliarlo in sezioni di 50 micrometri. Utilizzando un piccolo pennello, trasferire le crio-sezioni in una piastra da 96 pozzetti contenente 200 microlitri di soluzione antigelo in ogni pozzo.

Dopo questo, conservare la piastra a meno 20 gradi Celsius. Per iniziare, riempire alcuni dei pozzi di una piastra fresca da 96 po 'con 100 microlitri di soluzione di lavaggio. Trasferire le sezioni da analizzare dalla piastra di stoccaggio a quella contenente la soluzione di lavaggio.

Lasciare le sezioni nella soluzione di lavaggio per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, trasferire ogni sezione in un pozzo vuoto contenente la stessa soluzione di lavaggio e ripetere il lavaggio. Successivamente, aggiungere la soluzione di lavaggio alle sezioni e trasferirle in nuovi pozzi contenenti 100 microlitri di soluzione di blocco.

Incubare a temperatura ambiente per almeno 90 minuti e un massimo di quattro ore. Diluire gli anticorpi primari, anti-PGP9.5 e anti-5G4, nella soluzione di lavoro. Trasferire le sezioni in nuovi pozzi contenenti 100 microlitri della soluzione di lavoro degli anticorpi primari e incubare durante la notte a temperatura ambiente.

Il giorno successivo, lavare le sezioni in pozzi contenenti soluzione di lavaggio come descritto in precedenza. Diluire gli anticorpi secondari, Goat anti-Rabbit per rilevare PGP9.5 e Goat anti-Mouse per rilevare 5G4, nella soluzione di lavoro. Trasferire le sezioni lavate in nuovi pozzi contenenti 100 microlitri della soluzione di lavoro degli anticorpi secondari.

Coprire la piastra con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento del fluorofore coniugato con anticorpi secondari e incubare a temperatura ambiente per 90 minuti. Successivamente, lavare le sezioni due volte nella soluzione di lavaggio come descritto in precedenza. Trasferire le sezioni lavate in nuovi pozzi contenenti 100 microlitri di DAPI per cinque minuti a temperatura ambiente.

Lavare le sezioni due volte nella soluzione di lavaggio come descritto in precedenza. Quindi, montare le sezioni su una diapositiva nella posizione corretta, evitando errori di piegatura. Aggiungere alcune gocce di supporto di montaggio allo scivolo e coprire la sezione con uno slittamento del coperchio.

Lasciare asciugare gli scivoli durante la notte. Il giorno successivo, conservare le diapositive in una casella appropriata a quattro gradi Celsius, assicurandosi di evitare l'esposizione alla luce. Utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito o un microscopio confocale, visualizzare le sezioni.

Acquisire le immagini da una fotocamera collegata al microscopio. Quindi, utilizzare un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale per analizzare i segnali positivi in sezioni in termini di distribuzione spaziale e intensità del segnale come delineato nel protocollo di testo. Seguendo il metodo descritto, gli aggregati di alfa sinucleina etichettati con anticorpi 5G4 vengono rilevati nei fascicoli nervosi dermici che innervano le strutture autonomiche dei pazienti affetti da PD.

La morfologia dei depositi di alfa sinuleina appare come un segnale punteggiato lungo gli assoni dei nervi dermici. L'uso rappresentativo di questo protocollo in 19 pazienti PD e 17 controlli nelle biopsie cutanee in tre siti anatomici mostra che il 5G4 ha una sensibilità dell'81% e una specificità dell'86% rispetto ai controlli sani. La sinuleina alfa fosforilata ha una sensibilità del 56% e una specificità del 100%5G4 e depositi alfa sinuleina positiva fosforilati si trovano principalmente intorno alle ghiandole sudoripare, ma si trovano anche nell'arrector pili muscolare, nei piccoli vasi e nel plesso subepidermico e dermico, ma mai nelle fibre nervose intraepidermiche.

Generalmente, all'interno del lume delle ghiandole sudoripare, è possibile osservare un segnale non specifico che potrebbe essere interpretato erroneamente come positività 5G4 o alfa sinuleina fosforilata. Questo tipo di segnale è punteggiato, sferico, ed è dovuto molto probabilmente al materiale autofluorescente intraluminale come dimostrato nei controlli tecnici senza anticorpi primari e secondari. La colocalizzazione con PGP9.5 che segna le fibre nervose, morfologicamente filamentose e allungate, aiuta a identificare il segnale corretto.

Pertanto, la specificità del segnale 5G4 è altamente aumentata da una doppia immunostaining con un marcatore assonale. Una fissazione accurata della biopsia è necessaria per produrre una colorazione immunofluorescente di buona qualità e per l'interpretazione affidabile dei segnali fluorescenti. Se il fissatore non è preparato correttamente, o se si è verificata una fissazione troppo, il risultato sarà un'alta autofluorescenza che maschera il segnale delle fibre nervose che attraversano la giunzione dermica-epidermica o innerva le principali strutture dermiche.

Il passaggio più critico di questa procedura è la fissazione dei tessuti. Prestare attenzione al pH della soluzione fissante PLP e alla tempistica dell'incubazione, per evitare l'autofluorescenza e un segnale specifico.