Pretrattamento tissutale FFPE per RNA CISH: una procedura per elaborare sezioni di tessuto incluse in paraffina fissate in formalina per l'ibridazione in situ cromogenica a RNA

Il pretrattamento di sezioni di tessuto fissate in formalina, incluse in paraffina o FFPE facilita l'esposizione degli acidi nucleici e consente il legame delle sonde marcate alla sequenza target durante la successiva ibridazione in situ. Inoltre, il pretrattamento aiuta a mantenere l'integrità degli acidi nucleici all'interno delle cellule e la morfologia complessiva dei tessuti.

Per iniziare, prendi un vetrino che trasporta una sezione di tessuto FFPE deparaffinizzata e reidratata di interesse. Trattare il tessuto con un'adeguata concentrazione di perossido di idrogeno e incubare.

Il perossido di idrogeno inattiva irreversibilmente la perossidasi endogena, che è fisiologicamente presente nelle cellule. Questo processo di blocco elimina la possibilità di segnali di fondo non specifici durante le successive fasi di ibridazione.

Successivamente, immergere la sezione di tessuto in un bagno riscaldato contenente un tampone di recupero dell'antigene appropriato. Incubare per la durata desiderata. L'alta temperatura scinde i legami incrociati chimici indotti dal fissativo nelle proteine e negli acidi nucleici, esponendo gli epitopi non mascherati alle sonde durante la successiva marcatura.

Infine, trattare il campione con una soluzione di proteasi adatta. Incubare in un ambiente a umidità controllata. Le proteasi aumentano l'accessibilità dell'RNA, facilitando le sonde specifiche a raggiungere la loro sequenza bersaglio nelle successive fasi di ibridazione.

Lavare la sezione con acqua per rimuovere eventuali proteasi residue. Utilizzare la sezione di tessuto pretrattato per l'ibridazione cromogenica in situ dell'RNA.

Per bloccare l'attività della perossidasi su vetrini con sezioni di tessuto precedentemente deparaffinate e poste in un rack per vetrini, aggiungere da 4 a 6 gocce, quanto basta per coprire il campione, di perossido di idrogeno a ciascun vetrino e incubarle per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini due volte per 2 minuti in acqua distillata a temperatura ambiente. Per rompere i limiti del tessuto dell'RNA e le sezioni di tessuto, per prima cosa, rimuovi il foglio di alluminio dal TRR1x bollente usando un artiglio e smetti di mescolare.

Immergere il rack per vetrini lentamente e con molta attenzione. Coprite nuovamente il becher con un foglio di alluminio e incubate per 15 minuti. Utilizzare l'artiglio per trasferire immediatamente la griglia per vetrini caldi in un bagnomaria distillato e lavarla per 2 minuti. Lavare i vetrini poi in etanolo fresco al 100% per 2 minuti e lasciarli asciugare a temperatura ambiente per 2 minuti.

Quindi, utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare una barriera attorno a ciascun campione e lasciarlo asciugare per almeno 5 minuti. Per la digestione della proteasi, posizionare i vetrini nel vassoio di controllo dell'umidità e aggiungere circa 4 gocce di Protease Plus per campione. Coprite la teglia con un coperchio e inseritela nel forno di ibridazione per 30 minuti a 40 gradi centigradi.

Togliere la teglia dal forno e rimuovere la griglia scorrevole. Lavorando un vetrino alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e posizionare il vetrino nel rack per vetrini immerso in una vaschetta per colorare riempita con acqua distillata. Lavare i vetrini due volte per 2 minuti in acqua distillata a temperatura ambiente agitando costantemente.