Name: Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione In Situ Ibridazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Scopri l'ibridazione in situ ad alta risoluzione per rilevare mRNA localizzati negli assoni nel cervello di topo e umano. Questo metodo combina immunistochimica per studiare l'espressione genica neuronale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dall'Alzheimer's Association (NIRG-10-171721; all'U.H.), al National Institute of Mental Health (MH096702; all'U.H.), al National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; al C.M.T.), e da premi per studi pilota dall'Alzheimer's Disease Research Center della Columbia University (AG008702; a J.B. e Y.Y.J.) che supporta anche la New York Brain Bank. Ringraziamo i membri del laboratorio Hengst per i commenti e le discussioni

Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal IACUC della Columbia University e le linee guida applicabili per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio sono stati seguiti. Nota: Preparare tutti i buffer utilizzati per le procedure ISH in acqua RNase-free o DEPC trattati. Questa raccomandazione non è strettamente necessario dopo ISH è stato completato, ma si suggerisce che buffer sono ancora preparati in acqua bidistillata autoclave e / o sterilizzati grazie al filtro. 1. Individuazione di ATF4 mRNA localizzata a colinergica assoni nel Adult mouse cervello utilizzando ibridazione in situ fluorescente (FISH) Seguito da immunoistochimica <ol><li> Preparazione del campione per le fette di cervello congelati paraformaldeide-fisso <ol><li> Per il seguente esempio, preparare le fette di cervello di topo congelati fissi. <ol><li> In breve, sacrifica 9 mesi di età i topi da anestesia con ketamina (100 mg kg -1 di peso corporeo) e xilazina (10 mg kg -1 corpo weigHT), seguita da un&#39;infusione transcardial del 4% paraformaldeide in PBS (pH 7,4). </li><li> Rimuovere cervelli e post-fix in paraformaldeide al 4% per 24 ore a 4 ° C. </li><li> Dopo la fissazione, lavare campioni tre volte in PBS e cryoprotect a 30% di saccarosio in PBS (pH 7,4) per 24 ore a 4 ° C. </li><li> Cervelli Incorpora in ottobre congelamento composto, in serie sezione a 20 micron su un criostato e montare su poli-D-lisina vetrini da microscopio trattati. Tenere fettine di cervello a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Rimuovere paraformaldeide-fisso fette di cervello dal congelatore e asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare tre volte con PBS 1x. </li><li> In una cappa aspirante, ri-fix cervello affetta 20 min con paraformaldeide 4% a temperatura ambiente. NOTA: ATTENZIONE: 4% paraformaldeide è tossico e deve essere maneggiato ed eliminato in modo appropriato seguendo protocolli di sicurezza. </li><li> Lavare tre volte con PBS 1x. </li><li> Disidratare fettine di cervello. <ol><li> Preparare 50%, 75% e 100%Soluzioni di etanolo. </li><li> Immergere vetrini in etanolo al 50% per 5 minuti a RT. </li><li> Immergere vetrini in etanolo al 75% per 5 minuti a RT. </li><li> Immergere vetrini in etanolo al 100% per 5 minuti a RT. </li><li> Immergere i vetrini in fresco 100% di etanolo per 5 minuti a temperatura ambiente. Nota: In alternativa, i vetrini possono essere conservati in 100% di etanolo a -20 ° C fino a 1 mese. </li></ol></li></ol></li><li> Saggio FISH seguita da immunoistochimica utilizzando calore indotta antigene / RNA smascheramento <ol><li> Prima di iniziare preparare tutto il materiale necessario: <ol><li> Riscaldare il forno di ibridazione a 40 ° C e posizionare una vaschetta contenente acqua distillata in forno per creare un ambiente umidificato. </li><li> Prendete una scatola di diapositive e mettere gli asciugamani di carta imbevuti di acqua distillata all&#39;interno per umidificare la casella di scorrimento. Posizionare la casella di scorrimento nel forno di ibridazione. </li><li> Rimuovere sonde (entrambe le sonde negativi e target) da frigo e riscaldare in forno di ibridazione per 10 min. Lasciate raffreddare le sonde down a temperatura ambiente. </li><li> Equilibrare i reagenti di amplificazione AMP 1-4 (incluso nel kit fluorescente Multiplex Reattivo) a temperatura ambiente. </li><li> Preparare la soluzione di recupero dell&#39;antigene: 10 mm di citrato di sodio (pH 6), 0,05% di Tween 20. Nota: soluzione può essere conservata a temperatura ambiente a tempo indeterminato e possono essere usate per la futura colorazione. </li><li> Preparare il tampone di lavaggio 1x diluendo la soluzione 50x azione (incluso nel kit fluorescente Multiplex Reattivo) in acqua RNase-free o DEPC trattati. NOTA: il tampone di lavaggio 1x può essere conservato a temperatura ambiente per 1 mese e possono essere usate per la futura colorazione. Tampone di lavaggio 50x potrebbe precipitare. Se è così, il calore 50x tampone di lavaggio a 40 ° C per 10 min prima di preparare la soluzione 1x. </li></ol></li><li> Estrarre i vetrini da 100% di etanolo e asciugare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare una vaschetta Coplin contenente 50 ml di soluzione di recupero dell&#39;antigene. Immergere i vetrini in soluzione recupero dell&#39;antigene e lessateli per 10 minuti in un forno a microonde. NOTA: In alternativa luogo scorre orizzontalmente in un 100 millimetriDiametro piatto di vetro rotondo contenente 100 ml di soluzione di recupero. <ol><li> Riempire un bicchiere 1 L con acqua distillata e metterlo nel forno a microonde. NOTA: L&#39;acqua &quot;tampone&quot; il calore durante l&#39;esecuzione di smascheramento. </li><li> Porre i vetrini in soluzione recupero dell&#39;antigene all&#39;interno del forno a microonde. Bollire scorre ad alta potenza per 5 min. Subito dopo i campioni hanno smesso di bollire, calore scivola di nuovo ad alta potenza per extra di 5 min. </li><li> Raffreddare i vetrini a temperatura ambiente. NOTA: PUNTO CRITICO: ebollizione durata e procedura dovrebbero essere specificati dall&#39;utente, a seconda delle caratteristiche microonde. Il più veloce l&#39;ebollizione inizia maggiore è la probabilità di soluzione evaporazione. In questo caso si raccomanda che i campioni sono bolliti per periodi di tempo più brevi più di due volte per completare un tempo smascheramento totale di 10 min. Al contrario, se si esegue il riscaldamento a potenza media o bassa, smascheramento può essere eseguita una volta per 10 min. Tuttavia, se i campioni non bollire continuously per un totale di circa 10 minuti, questo può comportare smascheramento parziale sia del RNA e proteine ​​bersaglio da rilevare. </li></ol></li><li> Lavare i vetrini tre volte con PBS 1x. </li><li> Aggiungere 2-3 gocce (~ 100 microlitri) della sonda dapB impostato su quelle fette di cervello utilizzate per valutare la colorazione di fondo. Nota: La sonda set dapB si rivolge a un gene batterico e non deve rilevare alcuna RNA mammiferi. </li><li> Aggiungere 2 - 3 gocce di sonda targeting impostati a quelle fettine cerebrali utilizzati per rilevare l&#39;RNA di interesse. Nota: un set di sonde di targeting residui 20 - 1.381 del mouse ATF4 mRNA viene utilizzato in questo esempio. </li><li> Coprire i vetrini con parafilm per evitare sonda evaporazione, metterli nella casella diapositiva umidificata all&#39;interno del forno di ibridazione e incubare a 40 ° C per 2 ore. NOTA: OPTIONAL: fettine di cervello aggiuntivi possono essere ibridate con un set di sonde di targeting del mouse Polr2A e utilizzati come controlli positivi. </li><li> Wash slides due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2-3 gocce di amplificazione reattivo AMP 1-FL a ogni fetta cerebrale, coprire i vetrini con parafilm, metterli in scatola diapositive e incubare a 40 ° C per 30 minuti nel forno di ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2-3 gocce di amplificazione reattivo AMP 2-FL a ogni fetta cerebrale, coprire i vetrini con parafilm, metterli in scatola diapositive e incubare a 40 ° C per 15 minuti nel forno di ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2-3 gocce di amplificazione reattivo AMP 3-FL a ogni fetta cerebrale, coprire i vetrini con parafilm, metterli in scatola diapositive e incubare a 40 ° C per 30 minuti nel forno di ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2-3 gocce del reagente di amplificazione AMP 4 FL a ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm, metterli inscivolo box e incubare a 40 ° C per 15 min in forno ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente e due volte con PBS 1x. </li><li> Aggiungere 100-200 microlitri (o volume sufficiente a coprire completamente fette) di una soluzione di saturazione contenente 3 mg / ml BSA, glicina 100 mM e 0,25% Triton X-100 in PBS (pH 7,4) per le diapositive, coprire con parafilm e incubare per 30 minuti a RT. </li><li> Aggiungere 100-200 ml di anticorpo anti-ChAT diluito in una soluzione bloccante (1/100) per le diapositive, coprire con parafilm e incubare per 2 giorni a 4 ° C. Assicurarsi che le fette di cervello non si asciugano. Se necessario, riapplicare soluzione di anticorpi anti-chat per fettine di cervello di 24 ore dopo l&#39;incubazione. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in PBS 1x per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 100-200 ml di anticorpo secondario Alexa coniugato adeguato (es., Alexa-594 asino anti-capra per questo particolare esempio) per le diapositive, coprire con parafilm e incubmangiato per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in PBS 1x per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini una volta con acqua distillata. </li><li> Montare i vetrini con mezzo di montaggio-DAPI contenenti. </li><li> Visualizzare fette di cervello sotto un microscopio a fluorescenza. </li></ol></li></ol> 2. Individuazione di ATF4 mRNA localizzato a assoni in campioni di cervello umano per mezzo di ibridazione in situ (CISH) Seguito da Luxol Fast Blue e violetto cresolo Controcolorazione <ol><li> Preparazione dei campioni per i campioni di cervello umano inclusi in paraffina fissati in formalina <ol><li> Cuocere le fette in forno a secco a 60 ° C per 1 ora. </li><li> Deparaffinare fettine di cervello in una cappa aspirante. NOTA: ATTENZIONE: i reagenti sono tossici e devono essere gestiti e smaltiti seguendo le linee guida di sicurezza appropriate <ol><li> Immergere i vetrini in xilene stanza di compensazione alternativa due volte per 10 min. </li><li> Immergere i vetrini in etanolo al 100% due volte per 1 min. </li><li> Lafette ir-secco 5 minuti a temperatura ambiente. Nota: In alternativa i campioni possono essere asciugati a RT O / N, ma devono essere utilizzati entro 24 ore. </li></ol></li></ol></li><li> Diamminobenzidina (DAB) a base di test ISH cromogenico seguito da Luxol veloce macchia blu-violetto e cresil utilizzando indotta dal calore e la proteasi indotta RNA smascheramento <ol><li> Prima di iniziare preparare i materiali necessari: <ol><li> Riscaldare il forno di ibridazione a 40 ° C e posizionare una vaschetta contenente acqua distillata per creare un ambiente umidificato. </li><li> Prendete una scatola di diapositive e mettere gli asciugamani di carta imbevuti di acqua distillata all&#39;interno per umidificare la casella di scorrimento. Posizionare la casella di scorrimento nel forno di ibridazione. </li><li> Preparare 1x Pretrattare 2 diluendo la soluzione 10x (inclusa nel kit CISH reagente) in acqua RNase-free o DEPC trattati. Se pretrattamento viene eseguito su una piastra calda, aggiungere 100 ml di soluzione Pretrattare ad un piatto di vetro del diametro di 100 mm e aumentare la superficie di contatto tra il piatto e la piastra calda (se pretrattamentoviene eseguito in un forno a microonde, una vaschetta Coplin può essere utilizzato invece come specificato in 1.2.3). Soluzione di calore a 100 ° C e mantenerla non più di 30 min bollente prima sommergendo campioni. </li><li> Calore sonde negativi e positivi 10 min a 40 ° C e raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Equilibrare i reagenti di amplificazione AMP 1-6 (incluso nel kit CISH reagente) a temperatura ambiente. </li><li> Preparare il tampone di lavaggio 1x diluendo la soluzione 50x azione (incluso nel kit di reagenti CISH) in acqua distillata. Nota: 1x tampone di lavaggio può essere conservato a temperatura ambiente per 1 mese e possono essere usate per la futura colorazione. </li></ol></li><li> Aggiungi ~ 4 gocce (~ 120 microlitri) di Pretrattare 1 per ogni fetta cerebrale, coprire con parafilm e incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Lavare 3 a 5 volte in acqua distillata fresca. </li><li> Eseguire smascheramento calore indotto: <ol><li> Trasferire i vetrini a caldo Pretrattare 2 (incluso nel kit di reagenti CISH) di soluzione e far bollire per 15 minuti. Nota: Boiling può essere eseguita su un piatto caldo per garantireebollizione continua o in un forno a microonde seguendo i punti critici indicati 1.2.3). </li></ol></li><li> Trasferire immediatamente i vetrini di acqua distillata e lavare 3 a 5 volte. </li><li> Lavare i vetrini 3 a 5 volte a fresco al 100% di etanolo. </li><li> Far asciugare le fette 5 minuti a temperatura ambiente. Nota: O alternativa fette possono essere essiccati / N. </li><li> Eseguire smascheramento proteasi indotta: <ol><li> Aggiungere 4 gocce di Pretrattare 3 (incluso nel kit di reagenti CISH), coprire con parafilm e incubare 30 minuti a 40 ° C in forno ibridazione. </li></ol></li><li> Lavare i vetrini da 3 a 5 volte in acqua fresca distillata. </li><li> Aggiungere 4 gocce di sonda dapB impostato su quelle fette di cervello utilizzate per valutare la colorazione di fondo. </li><li> Aggiungere 4 gocce di sonda di targeting impostato quelle fettine cerebrali utilizzati per rilevare l&#39;RNA di interesse. NOTA: Un set di sonde di targeting residui 15 - 1.256 del ATF4 mRNA umano è utilizzato in questo esempio. OPTIONAL: fettine di cervello aggiuntivi possono essere hybridized con un set di sonde di targeting PPIB umano e usati come controlli positivi. </li><li> Mettere diapositive nella casella di scorrimento e incubare per 2 ore. a 40 o C in forno ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 4 gocce di AMP 1 reagente ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm, metterli nella scatola di diapositive e incubare a 40 ° C per 30 minuti nel forno di ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 4 gocce di AMP 2 reagente ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm, metterli nella scatola di diapositive e incubare a 40 ° C per 15 minuti nel forno di ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 4 gocce di AMP 3 reagenti per ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm, metterli nella scatola di diapositive e incubare a 40 ° C per 30 minuti nel forno di ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con 1x erah buffer per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 4 gocce di AMP 4 reagente ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm, metterli nella scatola di diapositive e incubare a 40 ° C per 15 minuti nel forno di ibridazione. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 4 gocce di AMP 5 reagente ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm e incubare 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 4 gocce di AMP 6 reagente ogni fetta cervello, coprire diapositive con parafilm e incubare 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Mescolare uguale volume di BROWN-1 e BROWN-2 reagenti (incluso nel kit di reagenti CISH), aggiungere ~ 120 ml di soluzione per ogni fetta cerebrale, coprire con parafilm e incubare 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini due volte con tampone di lavaggio 1x per 2 minuti a temperatura ambiente e sciacquare una volta in acqua distillata. NOTA: passaggi critici: i seguenti passaggi sono fondamentali perottenere un ottimale di contrasto assonale senza mascherare la presenza di granuli di RNA. </li><li> Prima di eseguire di contrasto verificare la presenza di mRNA di interesse al microscopio campo chiaro. Definire le aree di riferimento nei campioni di cervello in cui monitorare la presenza di puncta durante tutta la procedura di contrasto. </li><li> Luxol Preriscaldare soluzione blu veloce a 60 ° C. </li><li> Collocare i vetrini in Luxol blu veloce e incubare 30 minuti a 60 ° C. </li><li> Sciacquare più volte in acqua distillata. </li><li> Dip scorre più volte in 0,05% di soluzione di carbonato di litio per iniziare differenziazione. </li><li> Dip vetrini due volte in fresco 75% di etanolo. </li><li> Risciacquare in acqua distillata. </li><li> Controllare fettine di cervello al microscopio campo chiaro. Si noti che la materia grigia e bianca dovrebbe iniziare ad essere granuli distinguibili e RNA ancora visibili come blu scuro / puncta nero. Verificare che gli assoni alla prima comparsa come luce blu fibre. </li><li> Ripetere i passaggi da 2.2.28 a 2.2.32. Perform incubazione con Luxol veloce soluzione di blu in 10-20 min passi, controllando attentamente la di contrasto e la presenza di granuli di RNA. Nota: in genere, di contrasto ottimale è acquisito in 60-90 minuti (tempo totale di incubazione), ma il tempo può essere ridotto se si sospetta che i granuli di RNA potrebbero essere mascherati dalla Luxol veloce macchia blu (vedi figura 2 per gli esempi). </li><li> Incubare i vetrini in soluzione violetto cresolo per 10 minuti a RT. </li><li> Sciacquare i vetrini in acqua distillata. </li><li> Dip vetrini da 5 a 10 volte in 70% di etanolo. </li><li> Disidratare fettine di cervello attraverso 3 rapidi cambi di etanolo al 100%. </li><li> In una cappa aspirante, chiare fettine cerebrali incubando due volte in xilene agente di compensazione alternativa a 2 min e una terza volta per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Fettine di Monte cerebrali in mezzo di montaggio permanente basato xilene. </li><li> Analizzare i campioni al microscopio campo chiaro. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo rapporto si descrive l&#39;uso di una tecnologia ISH ad alta risoluzione per il rilevamento di assoni localizzato ATF4 mRNA. Questi ed precedenti studi pubblicati dimostrano che questa tecnologia è compatibile con la rilevazione di proteine ​​a base di anticorpi in tessuti o addirittura embrioni interi 33. Importante, è stato recentemente utilizzato per il rilevamento di Arc mRNA all&#39;interno dendriti dei neuroni ippocampali 34. Può anche essere combinato con colorant...

Assonale reclutamento mRNA e traduzione locali consentono assoni di rispondere agli stimoli extracellulari in maniera temporalmente e spazialmente acuta 1. Intra-assonale sintesi proteica si comprende meglio nel contesto del neurosviluppo in cui svolge un ruolo cruciale nella crescita comportamento cono 2-8, assone Pathfinding 9-11 e retrogrado segnalazione 12,13. Ma molto meno si sa circa il significato funzionale di assonale sintesi proteica nei neuroni post-sviluppo quando i livelli di mRNA e ribosomi assonale sono notevolmente ridotte 14,15. Assoni vertebrati maturi sono stati a lungo pensato di essere traslazione attivo 16. Tuttavia, studi recenti indicano che la traduzione locale viene riattivato negli assoni maturi in condizioni patologiche. Per esempio, un sottoinsieme di mRNA viene reclutato per assoni rigeneranti seguente è richiesta lesioni nervose e intra-assonale sintesi proteica per la corretta rigenerazione di questi assoni 17. Inoltre, il nostro gruppo has dimostrato che specifici mRNA sono reclutati per assoni dopo l&#39;esposizione locale per la malattia di Alzheimer peptide Ap 1-42, e la traduzione locale del fattore di trascrizione ATF4 è necessaria per propagare gli effetti neurodegenerativi di Ap 1-42 da assoni al soma neuronale 18. Infine, le analisi di throughput elevato hanno rivelato che gli assoni maturi hanno un trascrittoma più complesso e dinamico di quanto previsto 18-21, soprattutto in condizioni patologiche. Alla luce di questi studi, un metodo altamente sensibile e specifico per rilevare è necessario mRNA assoni localizzati nel sistema nervoso adulto. Gran parte del lavoro sul reclutamento mRNA e traduzione locali negli assoni maturi è stata eseguita su neuroni in coltura. Ciò è particolarmente vero per le analisi del trascrittoma in quanto esistono metodi di coltura specializzate che permettono l&#39;isolamento degli assoni dalla somato-dendritica vano 18-20. Anche se questi studi hanno dato ins preziosiight nel ruolo della traduzione locale di assoni maturi, la questione se i neuroni in coltura rappresentano fedelmente la situazione in vivo o se mRNA reclutamento è una risposta di adattamento degli assoni a condizioni di coltura è ancora aperta. Pochi studi hanno fornito prove di mRNA assunzioni a maturare assoni in vivo. Ad esempio, la trascrizione che codifica per la proteina marcatore olfattivo è stato rilevato in assoni nei neuroni sensoriali adulti 22. Un transgene contenente la 3 &#39;UTR di β-actina mRNA viene trasportato assoni nei neuroni del sistema nervoso centrale e periferico in topi e si traduce localmente dopo periodi di sviluppo 23. Lamin b2 mRNA è localizzato a assoni retinici in Xenopues laevis girini e il suo esaurimento colpisce assone manutenzione dopo lo sviluppo assonale 21. Interferenza con il trasporto assonale della codifica mRNA per citocromo C ossidasi IV altera il comportamento del mouse 24. Infine, ATF4 mRNA si trova in adultiXON di topi e cervelli umani nel contesto di Ap 1-42 indotta neurodegenerazione 18. Alta velocità effettiva analisi del trascrittoma hanno dimostrato di essere utile per identificare i profili di mRNA in assoni isolati in vitro, ma hanno limitazioni per studi in vivo in quanto nei tessuti interi assoni non si trovano mai isolatamente, ma mescolati con i corpi cellulari neuronali, cellule gliali e altri tipi di cellule. Pertanto, tali analisi devono essere combinati con tecniche di imaging che confermano la localizzazione subcellulare di mRNA. RNA ibridazione in situ (ISH RNA) permette la rilevazione e visualizzazione di specifiche sequenze di RNA in cellule e tessuti. Tuttavia, i saggi originali RNA ISH erano adatte solo per l&#39;identificazione di RNA altamente abbondanti 25, che è raramente il caso di mRNA assoni localizzate. Negli ultimi decenni ci si è messi in via di sviluppo nuove tecnologie che permettono la rilevazione di mRNA a livello di singola molecola <sup&gt; 25,26. Ad esempio, Singer e colleghi hanno sviluppato le sonde ISH per rilevare mRNA in singole cellule, che consiste in 5 non sovrapposti fluorescente 50-mers (per i dettagli si riferiscono al 27). La differenza principale tra le tecniche sopra menzionate e quella qui descritta è che la successiva utilizza 20 doppia Z-struttura (non lineare) sonde che tipicamente colpiscono ~ 1 kb regione del RNA di interesse garantire specificità e bassi livelli di fondo. Le sonde sono poi ibridati con preamplificatore e amplificatore sequenze che vengono finalmente fluorescente o coniugati con enzimi che consentono reazioni cromogeni. Questi passaggi di amplificazione migliorare il rapporto segnale-rumore, rispetto ad altre tecnologie ISH 28. Qui si descrive due protocolli che utilizzano RNAscope combinato sia con fluorescenza immunocitochimica o con coloranti istologici che permettono di contrasto assonale. Entrambi i protocolli sono adatti per visualizzare la localizzazione assonale di ATF4 mRNA in mo adultiutilizzare e cervelli umani.

sonda <table><tbody><tr><td>personalizzata che mira ai residui 20-1.381 dell'mRNA di topo Atf4 (NM_009716)</td><td>Advanced Cell Diagnostics-sonda</td><td></td><td></td></tr> che mira a una <tr><td>sonda personalizzata 15-1.256 dell'mRNA umano ATF4 (NM_001675.2)</td><td>Advanced Cell Diagnostics-sonda</td><td></td><td></td></tr> a <tr><td>controllo negativo-DapB</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310043</td><td>sonda</td></tr><tr><td>sonda a controllo positivo-topo Polr2A (opzionale)</td>Sonda a <td>controllo</td> positivo <td></td><td>per 312471 Advanced Cell Diagnostics-PPIB</td></tr><tr><td>umano (opzionale)</td><td>Sonda a 313901 Advanced Cell Diagnostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Kit di reagenti multiplex fluorescenti (per la rilevazione della fluorescenza)</td><td>Kit di ibridazione</td><td></td><td></td> Advanced Cell Diagnostics 320850in situ</tr><tr><td>Kit di reagenti RNAscope 2.0 HD - MARRONE (per la rilevazione cromogenica)</td>Advanced <td>Cell Diagnostics</td><td>310035</td><td>in situ kit di ibridazione</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale anti-ChAT di capra</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit</td><td>American MasterTech</td><td>KTLFB</td><td></td></tr><tr><td>Clearify clearing agent (sostituto dello xilene)</td><td>American MasterTech</td><td>CACLEGAL</td><td></td></tr><tr><td>Supporto ProLong Gold&nbsp; medio con DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>DPX supporto</td><td>Sigma</td><td>6522</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevazione di assoni localizzato mrna nelle sezioni del cervello utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; in situ</em&gt; ibridazione

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNA sono spesso localizzate a assoni vertebrati ed è richiesta la loro traduzione locale per assone pathfinding o ramificazione durante lo sviluppo e per la manutenzione, la riparazione o la neurodegenerazione in periodi postdevelopmental. Analisi High Throughput hanno recentemente rivelato che gli assoni hanno un trascrittoma più dinamico e complesso di quanto previsto in precedenza. Queste analisi, tuttavia sono stati per lo più fatto in neuroni in coltura dove gli assoni possono essere isolate dai compartimenti somato-dendritiche. E &#39;praticamente impossibile raggiungere tale isolamento nei tessuti interi in vivo. Pertanto, al fine di verificare l&#39;assunzione di mRNA e la loro rilevanza funzionale in un animale intero, analisi trascrittoma dovrebbero idealmente essere combinati con tecniche che permettono la visualizzazione di mRNA in situ. Recentemente, sono state sviluppate tecnologie ISH nuove che rilevano RNAs a livello di singola molecola. Ciò è particolarmente importante quando si analizza la localizzazione subcellulare di mRNA, RNA poiché localizzati trovano tipicamente a livelli bassi. Qui si descrive due protocolli per la rilevazione di mRNA assoni-localizzate utilizzando una nuova tecnologia ultrasensibile RNA ISH. Abbiamo unito RNAscope ISH con assonale di contrasto utilizzando la fluorescenza immunoistochimica o coloranti istologici per verificare l&#39;assunzione di ATF4 mRNA di assoni in vivo nel topo matura e cervello umano.

Un breve riassunto delle procedure sopra descritte è mostrato nella figura 1. Rilevazione ottimale di ATF4 mRNA granuli negli assoni colinergici con smascheramento indotta dal calore Nel valutare la localizzazione assonale di mRNA, è fondamentale per poter identificare gli assoni e di essere in grado di visualizzare bassa RNAs abbondanti. La tecnologia di RNA ISH qui descritta consente il rilevamento di RNA ad una risoluzione di una sing...

L'ibridazione in situ dell'RNA (ISH) consente la visualizzazione degli RNA nelle cellule e nei tessuti. Qui mostriamo come la combinazione di RNAscope ISH con immunoistochimica o coloranti istologici possa essere utilizzata con successo per rilevare mRNA localizzati negli assoni in sezioni di cervelli di topo e umani.

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare gli mRNA localizzati accidentalmente in campioni cerebrali adulti. Questo viene ottenuto pretrattando i campioni mediante bollitura e digestione con proteasi per svelare le molecole di mRNA; come secondo passaggio, viene effettuata l'ibridazione, seguita da fasi di amplificazione e rilevamento, che permettono la visualizzazione dell'mRNA di interesse.Successivamente gli assoni vengono colorati con anticorpi o coloranti per verificare che l'mRNA di interesse sia localizzato negli assoni. I risultati mostrano la presenza di un mRNA del fattore di trascrizione (TF) quattro in campioni cerebrali, utilizzando diverse procedure di svelamento e controcolorazioni, nonché metodi di colorazione basati su analisi microscopiche. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande nel campo delle neuroscienze, come ad esempio quali mRNA siano localizzati e tradotti in assenza di esoni.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla sintesi proteica intracellulare, può essere applicato anche ad altri sistemi, come le dendriti e le cellule e tessuti non neuronali in cui avviene il reclutamento dell'mRNA. Dopo aver fissato le sezioni di cervello, seguendo le istruzioni del protocollo scritto, preparare un barattolo Coplin contenente 60 millilitri di soluzione per il recupero dell'antigene e immergervi i vetrini. Successivamente, riempire un becher da un litro con acqua distillata e posizionarlo nel microonde per tamponare il calore.Quando si esegue lo smascheramento, posizionare il barattolo coplan contenente i vetrini e la soluzione di recupero nel microonde. Portare a ebollione i vetrini a potenza massima per cinque minuti. Immediatamente dopo che la soluzione ha smesso di bollire, riscaldare nuovamente i vetrini a potenza massima per altri cinque minuti.Lasciare raffreddare i vetrini a temperatura ambiente. Dopo il raffreddamento, immergere i vetrini in una vaschetta contenente PBS per lavarli, quindi ripetere il lavaggio altre due volte. Dopo il lavaggio, posizionare i vetrini su una superficie piana e aggiungere due o tre gocce oppure 100 microlitri di DAP B.Probe su due o tre sezioni cerebrali come controllo. Per valutare la colorazione di fondo, aggiungere due o tre gocce della sonda specifica alle sezioni sperimentali. Per rilevare l'RNA di interesse, viene utilizzata qui una sonda diretta contro i residui 20-1381 dell'RNA murino a TF four. Utilizzare pinzette per posizionare un parafilm sui vetrini al fine di evitare l'evaporazione della sonda.Quindi posizionare i vetrini nella scatola per vetrini umidificata all'interno del forno di ibridazione e incubarli a 40 gradi Celsius per due ore. Trascorso il tempo di incubazione, lavare i vetrini in una capsula con un x tampone di lavaggio per due minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere da due a tre gocce del reagente di amplificazione a MP uno fl a ciascuna sezione cerebrale.Quindi coprire con pellicola para fresca, mettere nella scatola per vetrini e incubare a 40 gradi Celsius per 15 minuti nel forno di ibridazione. Dopo aver lavato i vetrini come in precedenza, aggiungere due o tre gocce di reagente di amplificazione A MP four fl su ogni sezione cerebrale e coprire con perfil. Incubare i vetrini nella scatola per vetrini a 40 gradi Celsius per 15 minuti nel forno di ibridazione.Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio 1x per due minuti ciascuno a temperatura ambiente. Come in precedenza, dopo l'ultimo lavaggio, coprire ciascuna sezione con 100-200 microlitri di soluzione bloccante contenente 3 milligrammi per millilitro di BSA, 100 millimolari di glicina e 0,25% di Triton X-100 in PBS, coprire ogni vetrino con parafilm e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere 100-200 microlitri di anticorpo diluito nella soluzione bloccante sui vetrini. In questo caso si utilizza un anticorpo anti-colina acetiltransferasi; dopo aver coperto i vetrini con parafilm, incubare per due giorni a quattro gradi Celsius.Assicurarsi che le sezioni cerebrali non si secchino; se necessario, riapplicare la soluzione di anticorpo anti-CHATT alle sezioni cerebrali dopo 24 ore di incubazione. Dopo aver lavato i vetrini tre volte in 1x PBS per cinque minuti ciascun lavaggio, aggiungere a temperatura ambiente da 100 a 200 microlitri del corrispondente anticorpo secondario coniugato ad Alexa sui vetrini.Coprire con param e incubare per un'ora a temperatura ambiente, protetto dalla luce, al termine dell'ora. Lavare i vetrini tre volte in una XPBS per cinque minuti ciascuna, come in precedenza, quindi lavare una volta con acqua distillata. Montare i vetrini con mezzo di montaggio contenente DPI e quindi visualizzare le sezioni cerebrali al microscopio a fluorescenza.Dopo aver preparato campioni di cervello umano in formalina fissati e inclusi in paraffina, seguendo le istruzioni riportate nella parte scritta del protocollo, eseguire la rivelazione dell'antigene indotta dal calore immergendo i vetrini in soluzione pretrattamento due calda e facendo bollire per 15 minuti. Dopo aver lavato da tre a cinque volte in acqua distillata e da tre a cinque volte in etanolo fresco al 100%, lasciare asciugare i vetrini per cinque minuti a temperatura ambiente per eseguire la rivelazione dell'antigene indotta dalla proteasi. Aggiungere quattro gocce di pretrattamento tre, coprire con perfil e incubare per 30 minuti a 40 gradi Celsius nel forno di ibridazione dopo aver lavato da tre a cinque volte in acqua distillata.Come in precedenza, aggiungere quattro gocce del set di sonde DAP B alle sezioni cerebrali di controllo per valutare la colorazione di fondo e quattro gocce del set di sonde mirate alle sezioni sperimentali. Posizionare la coppia di vetrini coperti con pellicola nella scatola per vetrini e incubare per due ore a 40 gradi Celsius nel forno di ibridazione. Dopo aver seguito i passaggi del protocollo scritto per sviluppare il segnale DAB per l'mRNA di interesse, verificare la presenza di un segnale mediante microscopio in campo chiaro.Definire aree di riferimento nei campioni cerebrali in cui monitorare la presenza di puntini durante l'intero procedimento di controcolorazione. Per effettuare la controcolorazione, immergere prima i vetrini in blu luxal rapido preriscaldato a 60 gradi Celsius e incubare per 30 minuti a 60 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, risciacquare levetelle più volte in acqua distillata e quindi immergere le levetelle in una soluzione di carbonato di litio allo 0,05% per diverse volte per avviare la differenziazione. Successivamente, immergere le levetelle due volte in etanolo fresco al 75% e risciacquare in acqua distillata. Esaminare le sezioni cerebrali al microscopio in campo chiaro.Notare che materia grigia e materia bianca dovrebbero iniziare a essere distinguibili e i granuli di RNA dovrebbero essere ancora visibili come punti scuri blu scuro. Verificare che gli assoni inizino a comparire come fibre di colore celeste chiaro; ripetere la procedura di colorazione con luxol blue, incubando con il luxol blue a intervalli di 10-20 minuti e monitorando attentamente la controcolorazione e la presenza dei granuli di RNA, fino a quando non si raggiunge una colorazione ottimale. Posizionare i vetrini di lavaggio nella soluzione di violetto cresile e incubare per 10 minuti, successivamente all'incubazione.Risciacquare i vetrini in acqua distillata. Immergere i vetrini in etanolo al 70% da cinque a dieci volte, quindi disidratarli mediante tre passaggi rapidi in etanolo al 100% in una cappa da laboratorio. Schiarire le sezioni cerebrali incubandole due volte in xilene.Agente di chiarificazione alternativo per due minuti e una terza volta per cinque minuti. Montare le sezioni cerebrali a temperatura ambiente in un mezzo di montaggio permanente a base di xilene e analizzare al microscopio a campo chiaro. La tecnica FISH è stata eseguita mediante mascheramento indotto da proteasi seguito dalla rivelazione anticorpale della colina acetiltransferasi, mostrata in rosso.L'anticorpo non è riuscito a riconoscere chat quando è stato eseguito il trattamento con proteasi. Sono mostrati esempi di risultati ottenuti con una sonda non bersaglio e con una sonda che bersaglia il fattore di trascrizione quattro, utilizzando le stesse impostazioni del microscopio e le stesse regolazioni dell'immagine. Granuli verdi positivi per ATF quattro con localizzazione assonale non chiara sono indicati con punti interrogativi.Le aree blu sono nuclei colorati con DAPI in cui il pesce è stato sottoposto a recupero dell'antigene indotto dal calore. La colorazione immunofluorescente, mostrata nuovamente in rosso, è risultata positiva. Granuli positivi per TF4 localizzati negli assoni appaiono arancioni e sono indicati come OK; gli assoni successivi sono stati contrastati con Luxol.La SOTA rapida e neuronale è stata contrastata con violetto di cresta lussale subottimale. La colorazione con blu rapido può verificarsi se la temperatura viene ridotta. In questo caso, i campioni sono stati colorati con blu rapido lussale a 40 gradi Celsius per quattro ore.Granuli positivi per TF4 con localizzazione accidentale incerta sono indicati con punti interrogativi. Una colorazione subottimale si verifica anche quando l'intensità della controcolorazione non viene verificata dopo brevi periodi di incubazione, come mostrato in questo caso. Vengono qui riportati esempi di colorazione LFB ottimale combinata con ISH, utilizzando una sonda non specifica o la sonda specifica per TF4.L'acquisizione delle immagini è stata regolata automaticamente per ottenere il miglior rapporto segnale/rumore. L'assone localizzato in quattro granuli del fattore di trascrizione è indicato come accettabile. Una volta padroneggiato.Questa tecnica può essere eseguita in uno a tre giorni, a seconda del metodo di controcolorazione scelto, dopo il suo sviluppo. Questa tecnica apre la strada ai neuroscienziati per esplorare la traduzione e la localizzazione dell'mRNA con maggiore precisione.

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Doppia fluorescenza In situ</emIbridazione> nelle sezioni cervello fresco

Questo video descrive una strategia di ibridazione sequenziale che prevede l'ibridazione di sonde di mRNA su mRNA target specifici. Dopo l'ibridazione della sonda, viene eseguita l'amplificazione del segnale per migliorare la risoluzione attraverso la riduzione del rapporto segnale/rumore durante l'RNA-CISH dei campioni istologici.

Ibridazione con sonda e amplificazione del segnale nell'ibridazione in situ dell'RNA: una tecnica per rilevare specifiche sequenze di RNA in sezioni di tessuto

Fonte: Jolly, S., et.al. Combinazione di ibridazione a doppia fluorescenza  in situ con immunomarcatura per il rilevamento dell'espressione di tre geni in sezioni cerebrali di topo. J. Vis. Exp. (2016). Questo video dimostra l'uso dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per visualizzare l'espressione di due bersagli di RNA in sezioni cerebrali di topo. Il protocollo prevede il rilevamento sequenziale dell'RNA utilizzando sonde marcate con isotiocianato di fluoresceina e digossigenina,...

 Esecuzione dell'ibridazione in situ a doppia fluorescenza per rilevare l'espressione genica nelle sezioni cerebrali di topo

Fonte: Baleriola, J., et. al., Rilevamento di mRNA localizzati assonalmente in sezioni cerebrali utilizzando l'ibridazione in situ ad alta risoluzione.  J. Vis. Exp. (2015)Questo video dimostra il rilevamento dell'mRNA all'interno degli assoni colinergici in fette fisse di ippocampo di topo utilizzando l'ibridazione fluorescente in situ e la colorazione degli anticorpi. La microscopia a fluorescenza rivela la localizzazione spaziale degli mRNA marcati con sonda e della colina acetiltransferasi...

Immunocolorazione dei neuroni in fette di cervello di topo dopo ibridazione in situ a fluorescenza

Questo protocollo descrive un metodo di ibridazione in situ rapido e semplificato ideale per il cervello con prefisso di paraformaldeide, riducendo così la necessità di passaggi complessi prolungati durante l'utilizzo di tessuti freschi congelati.  Il metodo è convalidato utilizzando l'identificazione del gene del recettore della serotonina 5-HT2A htr2a nei ratti.

Rapido<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione utilizzando oligonucleotidi sonde su Paraformaldeide prefissa cervello di ratti con Sindrome serotoninergica

Localizzare l'espressione genica in specifici tipi di cellule può essere difficile a causa della mancanza di anticorpi specifici. Qui descriviamo un protocollo per la tripla rilevazione simultanea dell'espressione genica combinando l'ibridazione in situ a doppia fluorescenza con l'immunocolorazione.

La combinazione di doppio Fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

Questo protocollo descrive un metodo per combinare l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) e l'immunoistochimica a fluorescenza (IHC) in sezioni cerebrali di topo sia fresche congelate che fisse, con l'obiettivo di ottenere FISH multimarca e segnale IHC di fluorescenza. IHC ha preso di mira le proteine citoplasmatiche e attaccate alla membrana.

Combinazione dell'ibridazione in situ a fluorescenza multiplex con immunoistochimica fluorescente su sezioni cerebrali di topo fresche, congelate o fisse

L'ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione (EASI-FISH) è una tecnica robusta che combina la microscopia ad espansione con l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) per rilevare l'espressione di più geni nei tessuti spessi. Questo protocollo delinea i recenti progressi nel metodo e il suo adattamento per l'etichettatura del sistema nervoso centrale della Drosophila intatta.

Rilevamento multiplex dell'espressione genica nel cervello intatto di Drosophila mediante ibridazione in situ a fluorescenza iterativa assistita da espansione

Abbiamo messo a punto un saggio di ibridazione in situ Duplex per mappare le isoforme del recettore dell'insulina IR-A e IR-B nel plesso coroideo murino, superando i limiti dei metodi tradizionali. Questo approccio ad alta risoluzione rivela l'espressione specifica dell'isoforma, offrendo nuove intuizioni sulla segnalazione dell'insulina cerebrale e sulle potenziali terapie mirate all'isoforma per i disturbi neurologici.

Visualizzazione precisa dei recettori dell'insulina A e B nel cervello murino con un test di ibridazione in situ dell'RNA

Questo studio presenta un metodo robusto per isolare gli mRNA assonali utilizzando inserti di membrana porosi, permettendo la separazione totale tra neuroni e neuriti e la purificazione dell'RNA. Combinato con RTddPCR, l'approccio consente la quantificazione assoluta di trascritti a bassa copia, facilitando studi sul trasporto e la traduzione locale dell'mRNA con alta sensibilità, riproducibilità e ampia applicabilità sperimentale.

Isolamento e quantificazione degli mRNA assonali utilizzando inserti di membrana porosi e RTddPCR

Scopri l'ibridazione in situ ad alta risoluzione per rilevare mRNA localizzati negli assoni nel cervello di topo e umano. Questo metodo combina immunistochimica per studiare l'espressione genica neuronale.

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione

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