Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione In Situ Ibridazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di rilevare mRNA localizzati accidentalmente in campioni di cervello adulto. Ciò si ottiene mediante pretrattamento. I campioni mediante bollitura e digestione della proteasi per smascherare le molecole di mRNA come seconda fase Viene eseguita l'ibridazione, seguita da fasi di amplificazione e rilevamento, che consentono la visualizzazione dell'mRNA di interesse.

Gli assoni successivi vengono colorati con anticorpi o coloranti per verificare che l'mRNA di interesse sia localizzato negli assoni. I risultati mostrano la presenza di un mRNA TF four in campioni cerebrali utilizzando diverse procedure di smascheramento e contatori, metodi di colorazione basati su analisi microscopiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nelle neuroscienze, come ad esempio quali mRNA sono localizzati e tradotti senza esoni.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla sintesi proteica intracon, può essere applicato anche ad altri sistemi come i dendriti e le cellule e i tessuti non neuronali in cui avviene la localizzazione dell'mRNA. Dopo aver fissato le fette di cervello, secondo le istruzioni del protocollo scritto, preparare un barattolo di copin contenente 60 millilitri di soluzione per il recupero dell'antigene e immergere i vetrini nella soluzione. Quindi, riempi un bicchiere da un litro con acqua distillata e mettilo nel microonde per tamponare il calore.

Quando si esegue l'unmasking, posizionare il barattolo coplan contenente i vetrini e la soluzione di recupero nel microonde. Far bollire i vetrini ad alta potenza per cinque minuti. Subito dopo che la soluzione ha smesso di bollire, riscaldare nuovamente i vetrini ad alta potenza per altri cinque minuti.

Lasciare raffreddare i vetrini a temperatura ambiente Dopo il raffreddamento, immergere i vetrini in un piatto contenente PBS per lavarli e poi ripetere il lavaggio altre due volte Dopo il lavaggio, posizionare i vetrini su una superficie piana e aggiungere due o tre gocce o 100 microlitri di DAP B.Probe a due o tre sezioni cerebrali come controllo. Per valutare la colorazione di fondo, aggiungere due o tre gocce della sonda di puntamento alle sezioni sperimentali Per rilevare l'RNA di interesse, qui viene utilizzata una sonda che prende di mira i residui da 20 a 1381 di topo a quattro RNA TF. Utilizzare una pinza per posizionare il param sui vetrini per evitare l'evaporazione della sonda.

Quindi posizionare i vetrini nella scatola dei vetrini umidificati all'interno del forno di ibridazione e incubarli a 40 gradi Celsius per due ore. Trascorso il tempo di incubazione, lavare i vetrini in una piastra con un tampone di lavaggio per due minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere due o tre gocce di reagente di amplificazione a MP un fl a ciascuna fetta di cervello.

Quindi coprire con pellicola para fresca, posizionare nella scatola dei vetrini e incubare a 40 gradi Celsius per 15 minuti nel forno di ibridazione. Dopo aver lavato i vetrini come prima, aggiungere due o tre gocce di reagente di amplificazione A MP four fl a ciascuna fetta di cervello e coprire con perfil. Incubare i vetrini nella scatola dei vetrini a 40 gradi Celsius per 15 minuti nel forno di ibridazione.

Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per due minuti ciascuno a temperatura ambiente. Come prima, dopo l'ultimo lavaggio, coprire ogni fetta con 100-200 microlitri di soluzione bloccante contenente tre milligrammi per millilitro di BSA, 100 millimolare di glicina e 0,25% di Tritone X 100 in PBS, coprire ogni vetrino con paraforma e incubare per 30 minuti A temperatura ambiente dopo l'incubazione, aggiungere ai vetrini da 100 a 200 microlitri di anticorpo diluito in soluzione bloccante. Qui viene utilizzato un anticorpo anti colina acetil transferasi dopo aver coperto i vetrini con perfil incubare per due giorni a quattro gradi Celsius.

Assicurati che le fette di cervello non si secchino se necessario, riapplica la soluzione di anticorpi anti CHATT alle fette di cervello 24 ore dopo l'incubazione. Dopo aver lavato i vetrini tre volte in un XPBS per cinque minuti. A temperatura ambiente, aggiungere da 100 a 200 microlitri dell'anticorpo secondario coniugato Alexa appropriato ai vetrini.

Coprire con param e incubare per un'ora a temperatura ambiente al riparo dalla luce trascorsa un'ora. Lavare i vetrini tre volte in un XPBS per cinque minuti ciascuno come prima, quindi lavare una volta con acqua distillata. Montare i vetrini con un mezzo di montaggio contenente DPI e quindi visualizzare le fette di cervello al microscopio a fluorescenza.

Dopo aver preparato campioni formali e fissati di cervello umano inclusi in paraffina, secondo le istruzioni nella parte scritta del protocollo, eseguire lo smascheramento dell'antigene indotto dal calore immergendo i vetrini in una soluzione calda di pretrattamento due e facendo bollire per 15 minuti. Dopo il lavaggio da tre a cinque volte in acqua distillata e da tre a cinque volte in etanolo fresco al 100%, lasciare asciugare i vetrini per cinque minuti a temperatura ambiente per eseguire il mascheramento dell'antigene indotto dalla proteasi. Aggiungere quattro gocce di pretrattare, tre coprire con perfil e incubare per 30 minuti a 40 gradi Celsius nel forno di ibridazione Dopo aver lavato da tre a cinque volte in acqua distillata.

Come in precedenza, aggiungere quattro gocce del set di sonde DAP B per controllare le fette di cervello per valutare la colorazione di fondo e quattro gocce del set di sonda di targeting per le sezioni sperimentali. Posizionare la coppia di vetrini ricoperti di pellicola nella scatola dei vetrini e incubare per due ore a 40 gradi Celsius nel forno di ibridazione. Dopo aver seguito i passaggi del protocollo scritto per sviluppare il segnale DAB per l'mRNA di interesse, verificare la presenza di un segnale al microscopio a campo chiaro.

Definire le aree di riferimento nei campioni cerebrali in cui monitorare la presenza di puncta durante la procedura di controcolorazione. Per contrastare le macchie. Per prima cosa posizionare i vetrini in luxal fast blue preriscaldati a 60 gradi Celsius e incubare per 30 minuti a 60 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, sciacquare più volte i vetrini in acqua distillata e poi immergere più volte i vetrini in una soluzione di carbonato di litio allo 0,05% per avviare la differenziazione. Quindi, immergere due volte i vetrini in etanolo fresco al 75% e sciacquare in acqua distillata. Controlla le fette di cervello con un microscopio a campo chiaro.

Si noti che la materia grigia e bianca dovrebbero iniziare ad essere distinguibili e i granuli di RNA dovrebbero essere ancora visibili come punti neri blu scuro. Verificare che gli assoni inizino ad apparire come fibre azzurre, ripetere la procedura di colorazione con blu luxal, incubando con blu luxal in passaggi da 10 a 20 minuti e monitorando attentamente la colorazione di contrasto e la presenza di granuli di RNA quando è stata raggiunta una colorazione ottimale. Porre i vetrini di risciacquo in una soluzione di violetta crestale e incubare per 10 minuti dopo l'incubazione.

Sciacquare i vetrini in acqua distillata. Immergere i vetrini in etanolo al 70% da cinque a 10 volte e poi disidratare attraverso tre cambi rapidi di etanolo al 100% in una cappa aspirante. Elimina le fette di cervello incubando due volte in xilene.

Agente di compensazione alternativo per due minuti e una terza volta per cinque minuti. A temperatura ambiente montare le fette di cervello in un terreno di montaggio permanente a base di xilene e analizzarle al microscopio a campo chiaro. La FISH è stata eseguita utilizzando lo smascheramento indotto dalla proteasi seguito dalla rilevazione di anticorpi della colina acetil transferasi mostrata in rosso.

L'anticorpo non è riuscito a riconoscere la chat quando è stato eseguito il trattamento con proteasi. Vengono mostrati esempi di risultati ottenuti con una sonda non bersaglio e una sonda di puntamento TF four utilizzando le stesse impostazioni del microscopio e le stesse regolazioni dell'immagine. ATF verde: quattro granuli positivi con localizzazione assonale poco chiara sono indicati con punti interrogativi.

Le aree blu sono nuclei colorati quando il pesce è stato eseguito utilizzando l'antigene indotto dal calore. La colorazione immunofluorescente della chat smascherata, mostrata ancora una volta in rosso, ha avuto successo. A TF quattro granuli positivi localizzati agli assoni appaiono arancioni e sono contrassegnati come ok dopo che gli assoni ish sono stati contromacchiati con luxal.

Il blu veloce e il SOTA neuronale sono stati controcolorati con luxal subottimale viola crestale. Se la temperatura viene diminuita, può verificarsi una rapida colorazione blu. Qui i campioni sono stati colorati con luxal fast blue a 40 gradi Celsius per quattro ore.

Un TF quattro granuli positivi con localizzazione accidentale poco chiara sono indicati con punti interrogativi. La colorazione non ottimale si verifica anche quando l'intensità della controcolorazione non viene controllata dopo brevi periodi di incubazione, come si vede qui. Di seguito sono mostrati esempi di colorazione LFB ottimale combinata con ish utilizzando una sonda non bersaglio o una sonda di puntamento TF four.

L'acquisizione delle immagini è stata regolata automaticamente per ottenere il miglior rapporto segnale/rumore. Assone localizzato a TF quattro granuli sono contrassegnati come ok. Una volta padroneggiato.

Questa tecnica può essere eseguita in uno o tre giorni a seconda del metodo di colorazione di contrasto scelto dopo il suo sviluppo. Questa tecnica consente ai neuroscienziati di esplorare la traduzione e la localizzazione dell'mRNA nelle sfumature.