Ibridazione in situ per la localizzazione precisa delle Trascrizioni nelle piante

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di visualizzare i pattern di espressione dell'mRNA a livello cellulare con elevata sensibilità e specificità. Ciò si ottiene prelevando prima sezioni di tessuto formali e fisse e incluse in paraffina attraverso una serie di soluzioni per rimuovere la cera, permeare i tessuti e bloccare i gruppi minori caricati positivamente nei tessuti che possono produrre un segnale di fondo. Successivamente, una sonda di RNA marcata con DIG specifica per il gene di interesse viene infiltrata nelle sezioni di tessuto e i vetrini vengono ibridati durante la notte.

Successivamente, i vetrini vengono trattati con RNA. A per rimuovere la sonda non specificamente legata dalle sezioni e quindi incubata con anticorpi anti DIG. Ciò consente la visualizzazione della sonda ibridata mediante una reazione chimica metrica a colori.

I risultati mostrano un segnale blu scuro rilevabile al microscopio ottico in particolare in quelle cellule all'interno del tessuto in cui è espresso il gene di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle nostre altre analisi di espressione, come gli approcci R-T-P-C-R, microray o Next Generation Sequencing, è che il protocollo di ibridazione I mostrato qui rivela il pattern di espressione di un gene di interesse nel suo contesto tissutale. Questi metodi includono molti passaggi che possono essere appresi al meglio dalle dimostrazioni visive.

Mostreremo come sezionare e incorporare il tessuto, nonché i passaggi chiave del protocollo Al Hybridization pro che sono difficili da padroneggiare da soli. Il metodo di inclusione dei tessuti fissati con paraldeide varia a seconda del tipo di tessuto da analizzare. Il punto più importante qui è garantire che i campioni siano orientati correttamente per il successivo sezionamento.

Un metodo di incorporamento consiste nell'utilizzare stampi e anelli di plastica. Per iniziare questa procedura, scaldare gli stampini su una piastra riscaldante a 60 gradi Celsius e poi versare la paraffina fusa negli stampi. Quindi, utilizzare una pinza riscaldata per trasferire un campione di tessuto in ogni stampo e orientarlo nella posizione desiderata.

Spostare con cautela lo stampo dalla piastra al banco e posizionare l'anello bianco sullo stampo. Aggiungere altra mol e cera. Lasciare raffreddare e indurire gradualmente la cera prima del sezionamento.

Riscaldare i blocchi a temperatura ambiente, quindi tagliare ogni blocco in una forma trapezoidale, lasciando circa un millimetro di cera attorno al campione. Posizionare il blocco rifilato sul microtomo in modo che la più lunga delle due facce parallele si trovi in basso. Portare con cautela il blocco in avanti verso la lama e assicurarsi che la superficie del blocco sia parallela alla sezione della lama.

Con uno spessore da otto a 10 micron. Allineare i nastri di cera su una superficie antiaderente, come un foglio di alluminio, e selezionare le sezioni di interesse sotto un cannocchiale di dissezione. Quindi, segna le diapositive prob bon plus con una matita.

Non utilizzare penne sui pennarelli perché verranno cancellati durante il protocollo di ibridazione INI two. Distribuire un millilitro di acqua milli Q pulita su ogni vetrino. Far galleggiare con cura le sezioni di interesse sulla superficie dell'acqua a temperatura ambiente.

Assicurarsi che il lato lucido sia rivolto verso l'acqua. Trasferire lentamente il vetrino su uno scaldavetrini. Impostare a 35-37 gradi Celsius.

Questo intervallo di temperatura, al contrario dei 42 gradi Celsius comunemente usati, impedisce la formazione di bolle sotto le sezioni. Dopo cinque minuti, versare l'acqua con cautela ma con un movimento graduale in modo che il nastro venga abbassato sul vetrino. Lasciare asciugare i vetrini per almeno diverse ore o durante la notte a 37 gradi Celsius in modo che il tessuto aderisca per preparare le sezioni di tessuto.

Per l'ibridazione in situ, vengono prima depa e reidratati per la finalizzazione depa. Incubare i vetrini in due cambi di soluzione limpida per 10 minuti ciascuno. Per reidratare le sezioni di tessuto, far passare i vetrini attraverso una serie di concentrazioni decrescenti di etanolo per 30 secondi ciascuno.

Durante il trattamento con proteasi, che non viene mostrato in questo video, preparare un piatto di vetro con una soluzione di triammina triathlon molare 0,1 e posizionarlo su una piastra di agitazione in una cappa aspirante. Immediatamente prima di inserire la rastrelliera metallica nella soluzione, aggiungere 1,25 millilitri di anidride acetica nell'ammina da triathlon, nel tampone e nella tromba delle scale. Inoltre, impostare il sistema di bloccaggio e il supporto per tenere il rack per vetrini.

Ridurre la velocità dello Starr clamp il rack per vetrini sul supporto e abbassare il rack nella soluzione, mantenendolo sollevato sopra l'ancoretta di agitazione. Continuare a mescolare lentamente per 10 minuti dopo essere stato risciacquato in PBS e disidratato nuovamente attraverso una serie di etanolo. Le sezioni di tessuto sono pronte per l'ibridazione.

Posiziona i vetrini su una superficie pulita e lascia asciugare completamente l'aria per cinque-10 minuti. Preparare la miscela di tampone di ibridazione della sonda aggiungendo la sonda denaturata a 80 microlitri di tampone di ibridazione. Per ogni vetrino, mescolare bene pipettando più, evitando di formare bolle.

Pipettare il tampone di ibridazione della sonda. Mescolare sul bordo destro della diapositiva. Abbassare gradualmente un vetrino coprioggetti sul vetrino, assicurandosi che la soluzione di ibridazione copra tutte le sezioni senza bolle.

Picchiettare leggermente il coperchio, tagliare leggermente con il dito dove si formano le bolle per spostarle da tutte le sezioni di tessuto. Non estrarre la cesoia del coperchio in quanto ciò danneggerebbe le sezioni. Posizionare i vetrini in una camera di umidità contenente carta watman inumidita con acqua UE e in gran parte ricoperta di param.

Sigillare ermeticamente la scatola, incubare i vetrini alla temperatura di ibridazione desiderata, in genere da 50 a 55 gradi Celsius, per 16-20 ore. Al termine del protocollo di ibridazione, rimuovere con cura i vetrini coprioggetto dai vetrini. Il vetrino coprioggetto potrebbe semplicemente cadere quando il vetrino è posizionato in posizione verticale, ma in caso contrario, non estrarre il vetrino coprioggetti in quanto ciò danneggerebbe le sezioni.

Invece, immergere il vetrino in caldo 0,2 volte SSC per uno o due minuti per lavare via il vetrino coprioggetto dopo aver rimosso i vetrini coprioggetti, posizionare i vetrini in un rack e lavare più volte in 0,2 volte SSC a 55 gradi Celsius. Dopo un trattamento con RNA, trasferire i vetrini dal rack sul fondo di una scatola di plastica piatta e coprire con un volume minimo di soluzione bloccante. Bloccare i vetrini per 45 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma che si agita lentamente.

Quindi, applicare un volume minimo di soluzione anticorpale direttamente su ciascun vetrino. Incubare i vetrini al buio per due o tre ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, trasferire i vetrini in una scatola piatta pulita e lavarli quattro volte con un volume minimo di tampone di lavaggio su una piattaforma di agitazione a temperatura ambiente.

Sciacquare i vetrini una volta in TBS e due volte in TN buffer per applicare la soluzione colorante appena preparata sui vetrini. Per prima cosa, versare la soluzione colorante in un piccolo piatto di plastica. Quindi inserire due diapositive insieme con le sezioni una di fronte all'altra.

Immergere il panino nella soluzione, consentendo all'azione capillare di sollevare la soluzione. Scolare i vetrini su una salvietta kim. Riempire i vetrini con soluzione colorante.

Anche in questo caso, potrebbe essere necessario picchiettare i vetrini mentre la soluzione scorre per evitare bolle, posizionare i vetrini in una scatola di plastica e conservare la temperatura ambiente al buio. Qui sono mostrati i risultati rappresentativi ottenuti con diverse sonde e tessuti di arabidopsis. Il segnale viola fornisce una visualizzazione diretta alla risoluzione cellulare del pattern di espressione del gene di interesse.

Il pannello A mostra la localizzazione delle trascrizioni del germoglio Meli one nell'apice del germoglio vegetativo. Si noti la presenza di segnale violaceo-blu nell'indeterminato del meristema e la mancanza di segnale nelle foglie circostanti. I pannelli B 2D sono sezioni di embrioni allo stadio di siluro di arabidopsis in cui B mostra l'espressione di covata tre nelle poche cellule staminali embrionali.

C mostra un'espressione di T ML uno nello strato epidermico e D mostra la mancanza di segnale nelle sezioni sondate con un RNA di controllo negativo casuale. Queste immagini successive hanno mostrato i risultati ottenuti con diverse sonde su tessuti del labirinto. Il pannello E mostra la localizzazione di quello annodato STM Humalog nell'embrione del labirinto in via di sviluppo.

Si noti che il segnale forte, in particolare nel fusto embrionale della mes e nelle sezioni longitudinali della radice attraverso l'apice dello scivolo vegetativo, mostra che l'ARF tre A è espresso sulla superficie fogliare inferiore assiale nel pannello F e l'A T ML uno omologo OCL quattro è espresso specificamente nell'epidermide. Nel pannello G.As atteso, non è stato osservato alcun segnale di ibridazione per la sonda di controllo negativa nel pannello H. Le sonde di ibridazione in situ vengono controllate su un gel ARAZ standard dopo la trascrizione in vitro dopo il trattamento del DNA e la successiva purificazione della reazione di trascrizione in vitro Dopo l'idrolisi del carbonato e quando sono pronte per l'uso per sonde di lunghezza superiore a 250 paia di basi come la sonda uno, l'idrolisi del carbonato produrrà una gamma di frammenti di sonda più piccoli.

Questa figura mostra i risultati della qualificazione metrica e del colore delle sonde mediante diluizioni dell'analisi dot blot che vanno da 10 a meno uno a 10 a meno cinque di una sonda di controllo da 100 nanogrammi per microlitro e di tre, le sonde marcate con DIG appena marcate vengono individuate su una membrana di trasferimento incubata con anticorpi anti DIG e saggio. L'analisi suggerisce una concentrazione stimata di 100 nanogrammi per microlitro per la sonda due, 10 nanogrammi per microlitro per la sonda tre e un nanogrammo per microlitro per la sonda quattro, indicando che è improbabile che la sonda quattro produca una buona inea al segnale di ibridazione. Infine, queste sezioni longitudinali attraverso l'apice dello scivolo vegetativo di Mace forniscono un confronto tra un segnale di fondo non specifico e un pannello di sonda ben funzionante.

A mostra un segnale di fondo non specifico mentre il pannello B mostra un segnale specifico di ibridazione in situ due per la sonda OC cinque nello strato esterno della cella. Dopo aver visto questo, dovresti avere una buona idea di come eseguire molti dei passaggi difficili nei protocolli di ibridazione init in modo da poter determinare i precisi modelli di espressione temporale della pressione dei tuoi adolescenti preferiti.