Saggio di complementazione della luciferasi divisa per identificare specifiche interazioni proteina-proteina

Le interazioni proteina-proteina sono cruciali per le funzioni cellulari vitali.

Per studiare le interazioni tra le proteine transmembrana, proteine di membrana che attraversano il doppio strato lipidico della membrana cellulare, iniziare con i pozzetti di una piastra multi-pozzetto contenente una coltura cellulare di mammifero aderente.

Quindi, aggiungere una soluzione contenente un agente di trasfezione adatto e una coppia di plasmidi di espressione.

Uno dei plasmidi di espressione codifica per una proteina transmembrana di interesse fusa al piccolo frammento non funzionale dell'enzima luciferasi; l'altro plasmide codifica per una seconda proteina transmembrana di interesse fusa al grande frammento non funzionale dell'enzima luciferasi.

Incubare la piastra. L'agente di trasfezione facilita l'assorbimento cellulare dei plasmidi di espressione.

Le cellule trasfettate con successo esprimono le proteine transmembrana. L'interazione tra le proteine transmembrana espresse porta i frammenti piccoli e grandi rivolti verso il citoplasma in stretta prossimità, facendoli legare e formare l'enzima luciferasi attivo.

Sostituire il terreno nei pozzetti con terreno privo di siero per ridurre al minimo la luminescenza di fondo. Aggiungere la furimazina, un substrato di luciferasi permeabile alle cellule. La furimazina entra nelle cellule, dopodiché la luciferasi ossida la furimazina, generando luminescenza ad alta intensità.

Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare la luminescenza, che è indicativa della forte interazione tra le proteine transmembrana.

Raccogliere l'aderente HEK293T coltura cellulare mediante tripsinizzazione e risospendere le cellule in un terreno di crescita completo dedicato. Piastra le celle su una piastra a 96 pozzetti con fondo trasparente, lato bianco. Regolare il numero totale di pozzetti per adattarsi a tutte le combinazioni e i controlli testati, comprese le repliche. Quindi, coltivare le cellule durante la notte in condizioni standard.

Il giorno successivo, trasfettare le cellule con le combinazioni desiderate di plasmidi di espressione. Diluire i plasmidi in un terreno privo di siero a 6,25 nanogrammi per microlitro per ciascun costrutto e aggiungere il reagente di trasfezione a base di lipidi a un rapporto lipidi/DNA appropriato.

Incubare i plasmidi secondo le istruzioni del produttore. Quindi, aggiungere 8 microlitri della miscela lipidi-DNA ai pozzetti designati. Mescolare il contenuto della piastra con una rotazione delicata e coltivare le cellule per 20-24 ore in condizioni standard.

Il giorno successivo, sostituire il terreno condizionato in ogni pozzetto con 100 microlitri di un terreno privo di siero, assicurandosi che le cellule non si stacchino durante lo scambio del mezzo.

Poco prima di misurare la luminescenza, mescolare un volume di furimazina con 19 volumi di tampone di diluizione. Aggiungere 25 microlitri della soluzione di lavoro della furimazina in ciascun pozzetto e mescolare delicatamente la piastra a mano o con uno shaker orbitale.

Inserire la lastra in un lettore di micropiastre a luminescenza ed equilibrare la lastra a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Selezionare i pozzetti da analizzare e leggere la luminescenza con un tempo di integrazione di 0,3 secondi. Continuare a monitorare la luminescenza per un massimo di due ore, se necessario.