Saggio di elettrochemiluminescenza per la quantificazione dei livelli di proteine bersaglio nel lisato cerebrale

Per la rilevazione quantitativa di una proteina specifica nel lisato cerebrale di topo utilizzando l'elettrochemiluminescenza, ECL, immunodosaggio, iniziare con una piastra di saggio multipozzetto.

I pozzetti comprendono elettrodi conduttori di lavoro e controelettrodi, completando il circuito elettrico. Uno strato dielettrico separa gli elettrodi, migliorando la sensibilità del saggio.

Aggiungere ai pozzetti gli anticorpi monoclonali primari di topo contro la proteina bersaglio. Gli elettrodi di lavoro, con maggiore capacità di legame, facilitano l'immobilizzazione degli anticorpi su di essi.

Incubare con una soluzione contenente proteine, legandosi alle restanti superfici di legame del pozzetto, riducendo l'interferenza di fondo.

Aggiungere il lisato della frazione nucleare del cervello di topo. La proteina bersaglio nel lisato si lega specificamente agli anticorpi monoclonali.

Aggiungere anticorpi policlonali non marcati, riconoscendo e legandosi agli epitopi sulla proteina, che è legata agli anticorpi monoclonali primari sull'elettrodo. Aggiungere anticorpi secondari specifici marcati con il complesso di rutenio, legandosi agli anticorpi non marcati. Aggiungere un tampone adatto contenente tensioattivo, fornendo un ambiente di generazione ECL adatto, e tripropilammina, TPA.

Posizionare la piastra multipozzetto nel sistema di rilevamento ECL. Dopo l'applicazione del potenziale attraverso gli elettrodi, il complesso di rutenio legato agli anticorpi viene ossidato. Allo stesso tempo, il TPA si ossida e perde spontaneamente un protone.

Il radicale TPA risultante riduce il complesso di rutenio ossidato al suo stato eccitato. Dopo il rilassamento al suo stato fondamentale, il complesso di rutenio emette un fotone rilevato dal fotorivelatore.

L'intensità della luce misurata è rappresentativa della concentrazione proteica specifica del lisato.

Recupera la piastra a 96 pozzetti dal frigorifero e rimuovi la pellicola. Rimuovere la soluzione di rivestimento anticorpo dai pozzetti gettandola in un contenitore per rifiuti. Quindi, picchiettare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere la soluzione rimanente.

Quindi, aggiungi 125 microlitri di soluzione bloccante a ciascun pozzetto. Quindi, sigillare nuovamente la piastra con una pellicola adesiva. Posizionare la piastra su un agitatore orbitale per micropiastre, impostato a 800 giri/min, e incubarla per 90 minuti a temperatura ambiente.

Scongelare con ghiaccio, una fiala di soluzione madre proteica MeCP2 o TAT-MeCP2, lisati cerebrali di topo e lisati HDF. Diluire la soluzione madre proteica in provette pulite, come descritto nella Tabella 2 del manoscritto.

Quindi, diluire i campioni di lisato. Per i lisati cerebrali di topo, utilizzare da 1 a 20 microgrammi per 25 microlitri di tampone di lisi. Per il lisato HDF, aggiungere da 0,25 a 1 microgrammo per 25 microlitri di tampone di lisi.

Dopo che la piastra a 96 pozzetti è stata incubata per 90 minuti, rimuovere la soluzione bloccante dai pozzetti gettandola in un contenitore per rifiuti. Quindi, picchiettare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere la soluzione rimanente. Quindi, lavare la piastra 3 volte con 150 microlitri di soluzione di lavaggio, aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente.

Aggiungere 25 microlitri di standard e campioni ai pozzetti della piastra a 96 pozzetti. Sigillare la piastra e incubarla per altre quattro ore a temperatura ambiente, agitando costantemente a 800 giri/min.

Scongelare l'anticorpo di rilevamento non marcato, coniglio policlonale anti-MeCP2, su ghiaccio. Utilizzando la soluzione diluente del dosaggio, diluire l'anticorpo in un rapporto di 1:6000. Quando la piastra a 96 pozzetti ha terminato l'incubazione sull'agitatore, rimuovere gli standard e i campioni gettando la piastra in un contenitore di scarto. Quindi, picchiettare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere la soluzione rimanente.

Lavare la piastra 3 volte con 150 microlitri di soluzione di lavaggio aggiungendo la soluzione di lavaggio e rimuovendola immediatamente. Aggiungere 25 microlitri di soluzione di anticorpi di rilevamento non marcati a ciascun pozzetto con il pipettatore multicanale. Sigillare la piastra e incubarla per 1 ora a temperatura ambiente agitando costantemente a 800 giri/min.

Procurarsi l'anticorpo secondario specifico dal frigorifero e metterlo sul ghiaccio. Diluire l'anticorpo secondario in una soluzione diluente e mescolare delicatamente.

Per rimuovere l'anticorpo di rilevamento libero non marcato dalla piastra a 96 pozzetti, inserirlo nel contenitore dei rifiuti, quindi picchiettare la piastra su un tovagliolo di carta. Dopo aver lavato la piastra 3 volte, come precedentemente descritto, aggiungere 25 microlitri di anticorpi secondari a ciascun pozzetto con il pipettatore multicanale. Sigillare la piastra e incubarla per 1 ora a temperatura ambiente agitando costantemente a 800 giri/min.

Rimuovere l'anticorpo secondario libero gettandolo nel contenitore dei rifiuti e picchiettando la piastra su un tovagliolo di carta, quindi lavare la piastra tre volte come descritto in precedenza.

A ciascun pozzetto della piastra, aggiungere 150 microlitri di tampone di lettura Gold 1X a base di tris con tensioattivo, contenente tripropilammina come co-reagente per la generazione di luce.

Per evitare la produzione di bolle d'aria, utilizzare tecniche di pipettaggio inverso. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sulla piattaforma della micropiastra con un sistema di rilevamento dell'elettrochemiluminescenza.

Utilizzando la telecamera CCD integrata, iniziare immediatamente ad acquisire i dati. Registra i conteggi dei segnali che corrispondono alle unità di luce relative e sono direttamente proporzionali all'intensità della luce.