Saggio Dot Blot per quantificare il genoma virale

Per quantificare il DNA virale utilizzando il test del dot blot, iniziare con una sospensione di DNA virale isolata. Trattare con una soluzione alcalina per denaturare il DNA a doppio filamento in filamenti singoli per la successiva ibridazione.

Assemblare l'apparecchio per il dot blot con una membrana di nylon pre-bagnata. Caricare nei pozzetti DNA virale denaturato e soluzioni di DNA plasmidico standard linearizzato. Applicare un vuoto adatto, facilitando l'efficace trasferimento di DNA virale a filamento singolo con carica negativa e legandosi alla superficie della membrana caricata positivamente attraverso interazioni elettrostatiche, formando modelli di punti.

Dopo la seduta, lavare la membrana con tampone citrato di sodio, contribuendo a migliorare la sensibilità del saggio. Dopo l'essiccazione, esporre la membrana alla luce ultravioletta, reticolando il DNA macchiato alla membrana.

Aggiungere alla membrana un frammento di DNA denaturato termicamente e non eterologo e una sospensione di sonda di DNA marcata con fosforo radioattivo specifico per il genoma virale in tampone di ibridazione. Incubare, facilitando l'ibridazione.

I frammenti di DNA agiscono come agenti bloccanti, legandosi alle restanti regioni della membrana, riducendo al minimo il legame non specifico della sonda. La sonda radioattiva si ibrida con la sequenza complementare sul DNA virale a singolo filamento.

Lavare con tampone di lavaggio per rimuovere le sonde non ibridate. Utilizzando il sistema di scansione delle immagini al fosforo, quantificare i segnali radioattivi emessi dalle sonde radioattive ibridate al genoma virale sulla membrana, per ottenere segnali di dot blot.

Dalla curva standard, l'intensità del segnale di ciascun punto sulla membrana può essere utilizzata per calcolare la quantità di DNA virale nel campione.

Per eseguire il saggio di dot blot, preparare gli standard del DNA plasmidico diluendo il DNA plasmidico del genoma del vettore AAV a 10 nanogrammi per microlitro in acqua o tampone Tris-HCl. Trasferire un'aliquota di 25 microlitri di DNA plasmidico diluito in una nuova provetta e linearizzarla con un enzima di restrizione appropriato in un volume di reazione di 50 microlitri per un'ora.

Aggiungere 450 microlitri di acqua o TE alla provetta contenente lo standard del DNA plasmidico digerito e mescolare accuratamente. Quindi, trasferire 70 microlitri di questa miscela in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri con 1.330 microlitri di acqua o TE per creare uno standard plasmidico diluito.

Per impostare l'apparato di puntinatura, utilizzando le forbici, tagliare la membrana assorbente a una dimensione appropriata per il numero di campioni e gli standard. Immergere la membrana con acqua per 10 minuti, prima di posizionarla sull'apparecchio per macchie a punti. Quindi, copri i pozzetti inutilizzati. Aggiungere acqua ai pozzetti in cui verranno caricati i campioni. Applicare il vuoto, tirare l'acqua attraverso i pozzetti, verificare la presenza di errori e quindi serrare nuovamente le viti. Se necessario, ripetere il test.

Applicare 400 microlitri di ogni standard di DNA plasmidico diluito su ciascun pozzetto ed eseguire quattro corsie di diluizioni standard. Utilizzare due aliquote separate del digest standard e caricarle in duplicato. Quindi, applicare 200 microlitri per pozzetto di ciascun campione di DNA virale. Applicare un leggero vuoto per raccogliere le soluzioni di DNA attraverso i pozzetti. Quindi, una volta svuotati tutti i pozzetti, rilasciare il vuoto regolando la valvola a tre vie.

Aggiungere 400 microlitri di soluzione alcalina 1X a ciascun pozzetto. Quindi, attendere cinque minuti prima di riapplicare il vuoto per svuotare i pozzetti. Riapplicare il vuoto e smontare l'apparecchio per macchie di punti. Quindi, rimuovere la membrana e risciacquarla con 2X SSC.

Posizionare la membrana su un tovagliolo di carta pulito, con il lato legato al DNA rivolto verso l'alto, per rimuovere il tampone in eccesso. Utilizzare un reticolante UV appropriato per reticolare il DNA tamponato alla membrana. La membrana è ora pronta per l'ibridazione.

Metti la membrana in un flacone di ibridazione con il lato legato al DNA rivolto verso l'alto. Sciacquare la membrana con 5-10 millilitri di tampone di ibridazione preriscaldato e gettare il tampone. Quindi, aggiungere 10 millilitri di tampone di ibridazione preriscaldato e posizionare la bottiglia in un forno di ibridazione rotante impostato a 65 gradi Celsius. Ruotare la bottiglia per almeno cinque minuti.

Aggiungere rapidamente il DNA spermatico denaturato e la sonda radioattiva al tampone di ibridazione nel flacone e agitarlo per 10 secondi per mescolare. Rimetti la bottiglia nel forno a 65 gradi Celsius e incubala con rotazione a 65 gradi Celsius per almeno quattro ore.

Una volta completata l'ibridazione, arrestare la rotazione, rimuovere il flacone di ibridazione, quindi versare la soluzione della sonda radioattiva in un tubo conico da 50 millilitri con un tappo a tenuta stagna. Per lavare la membrana, aggiungere da 20 a 30 microlitri di tampone di lavaggio preriscaldato al flacone di ibridazione e ruotarlo per cinque minuti. Ripetere questo lavaggio altre due volte.

Dopo il terzo lavaggio, rimuovere la membrana dal flacone di ibridazione e, con carta assorbente, rimuovere il tampone in eccesso dalla membrana. Quindi, posizionare la membrana in un supporto di carta di plastica trasparente. Con un contatore Geiger, controllare i segnali radioattivi sulla membrana.

[TRILLING]

Dopo aver esposto lo schermo di imaging al fosforo cancellato alla membrana, eseguire la scansione dello schermo utilizzando un sistema di scansione dell'immagine al fosforo e ottenere i dati sull'intensità del segnale di ciascun punto.