Metodo basato su ELISA per analizzare le interazioni tra le proteine dell'esca e della preda

L'interazione fisica tra due partner proteici modula i meccanismi biologici a valle.

Per rilevare le interazioni proteina-proteina utilizzando il test di immunoassorbimento enzimatico, ELISA, prelevare una piastra di immunodosaggio multipozzetto. Aggiungere un tampone di rivestimento contenente una delle proteine interagenti – la proteina esca – e incubare. Le proteine dell'esca vengono adsorbite sulla superficie del pozzetto attraverso interazioni idrofobiche non specifiche.

Scartare la soluzione esaurita e lavare la piastra con un tampone per rimuovere le proteine non legate. Aggiungere una soluzione bloccante e incubare, consentendo alle molecole dell'agente bloccante della soluzione di bloccare i siti di legame non specifici sulla superficie del pozzetto.

Aggiungi il partner proteico interagente – la proteina della preda – etichettato con residui di istidina per una facile quantificazione. Incubare, consentendo alla proteina della preda di legarsi in modo specifico al suo partner interattivo: l'esca. Aggiungere una soluzione di anticorpi anti-istidina coniugati con enzimi perossidasi di rafano che si legano alla preda, formando un complesso esca-preda-anticorpo.

Pipettare una soluzione contenente il substrato dell'enzima e il perossido di idrogeno e incubare.

L'enzima perossidasi di rafano utilizza il perossido di idrogeno per l'ossidazione catalitica del suo substrato, formando un prodotto di colore blu. Aggiungere una soluzione acida che denatura l'enzima per fermare la reazione, formando un prodotto di reazione giallo.

Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare l'intensità del colore del prodotto, che è proporzionale alla quantità di proteina della preda legata e indica l'interazione proteina-proteina riuscita.

Per prepararsi all'ELISA, erogare 100 microlitri di soluzione proteica in ciascun pozzetto di una piastra per microtitolazione Polysorp. Chiudere le piastre con il coperchio e conservarle a 4 gradi Celsius durante la notte per facilitare l'immobilizzazione delle proteine sui pozzetti delle piastre per microtitolazione. Eliminare la soluzione dalla piastra per microtitolazione inclinandola a testa in giù sopra il lavandino. Quindi, lavare i pozzetti tre volte con 300 microlitri di PBS per pozzetto.

Bloccare i pozzetti rivestiti per 1 ora a temperatura ambiente con PBS, contenente il 2,5% in peso e volume di BSA. Dopo aver rimosso la soluzione bloccante, lavare i pozzetti tre volte con 300 microlitri di PBST per pozzetto. Ora, aggiungi 100 microlitri di PH ricombinante a 50 nanomolari con His-taged a ciascun campione. Nei pozzetti di controllo, aggiungere solo 100 microlitri di PBS-BSA. Incubare la piastra per 1 ora a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, scartare la soluzione proteica e rimuovere le proteine non legate lavando i pozzetti tre volte con 300 microlitri di PBST per pozzetto. Quindi, aggiungere 100 microlitri di PBS-BSA, contenente anticorpi policlonali anti-His coniugati con perossidasi di rafano.

Dopo l'incubazione per 1 ora a temperatura ambiente, lavare i pozzetti tre volte con 300 microlitri di PBST per pozzetto. Rilevare i complessi antigene-anticorpo aggiungendo 100 microlitri di reagente di rilevamento ELISA a ciascun pozzetto. Quindi, aggiungere 50 microlitri di acido solforico 1 molare per pozzetto per fermare la reazione. Misurare la densità ottica dei pozzetti a 450 nanometri, utilizzando un lettore di micropiastre.