Rilevamento basato sull'anisotropia della fluorescenza delle interazioni proteina-proteina

Per il rilevamento dell'interazione proteina-proteina basata sull'anisotropia della fluorescenza, iniziare con proteine bersaglio ricombinanti marcate con motivi di tetracisteina C-terminale in un tampone di anisotropia adatto.

Aggiungere un colorante contenente fluorofori, che si lega alle proteine bersaglio tramite il motivo della tetracisteina. Dializzare con il tampone anisotropia, rimuovendo il colorante non legato. Trasferire il composto in cuvette di quarzo. Misurare l'assorbanza, determinando la percentuale di proteine bersaglio marcate con successo.

In una cuvetta a fluorescenza, mescolare le proteine bersaglio marcate con fluoroforo con proteine non marcate. Utilizzando uno spettrofluorimetro, misurare l'anisotropia della fluorescenza.

Mentre le proteine bersaglio si bloccano liberamente nel tampone, i fluorofori ad esse attaccati ruotano in modo casuale attorno ai loro assi a causa del movimento browniano. Dopo l'eccitazione con luce polarizzata verticalmente di una lunghezza d'onda appropriata, i fluorofori emettono luce polarizzata sui piani verticale e orizzontale. Viene misurato il rapporto tra le intensità di fluorescenza delle emissioni polarizzate verticalmente e orizzontalmente (anisotropia).

Quando le proteine non marcate si legano ai bersagli marcati con fluorofori, la dimensione molecolare del complesso proteico aumenta, riducendo il suo movimento rotatorio. Di conseguenza, la luce emessa diventa più polarizzata, con un'emissione maggiore sul piano verticale rispetto al piano orizzontale, aumentando l'anisotropia.

Aggiungere concentrazioni crescenti della proteina non marcata e ripetere la misurazione dell'anisotropia.

Un aumento non lineare dell'anisotropia con l'aumento dell'aggiunta di proteine non marcate indica un legame proteico non marcato in più siti di legame non identici sulle proteine bersaglio marcate con fluorofori.

Mescolare 3 nanomoli della proteina SBDS-FlAsH con 3 nanomoli del colorante Lumio Green in un volume di 5 microlitri di tampone anisotropia. Lasciare procedere la reazione per 8 ore a 4 gradi Celsius. Dopo 8 ore, dializzare il campione contro il tampone di anisotropia durante la notte per rimuovere il colorante libero. Misurare l'assorbanza a 280 nanometri e 508 nanometri in uno spettrofotometro utilizzando una cuvetta di quarzo. Quindi, utilizzare la legge di Lambert-Beer per quantificare la percentuale di proteine marcate come descritto nel protocollo di testo.

Prima di misurare il valore di anisotropia, ogni fase di titolazione del ligando proteico deve essere eseguita attentamente, assicurandosi che l'intero campione venga erogato nella soluzione e diventi omogeneo.

In una cuvetta a fluorescenza, posizionare 200 microlitri di SBDS-FlAsH 30 nanomolari in tampone anisotropia e titolare 2 microlitri di EFL1 30 micromolare. Mescolare accuratamente e lasciare riposare la reazione per 3 minuti prima di misurare il valore di anisotropia e fluorescenza. Ripetere questo processo fino a quando non è stato aggiunto un volume totale di 40 microlitri di EFL1. Come passaggio finale, adattare i dati a un modello di associazione presunto, come descritto nel protocollo di testo.