Risonanza plasmonica di superficie per studiare le interazioni biomolecolari utilizzando un chip sensore

Per eseguire la risonanza plasmonica di superficie, o SPR, per studiare le interazioni biomolecolari, iniziare con un chip sensore posizionato su un rivelatore SPR in una cella a flusso. Questo chip sensore rivestito in metallo ha uno strato di materiale idrogel depositato sulla superficie del chip, che lo rende più adatto per l'immobilizzazione delle proteine.

Sovrapponi il chip con peptidi virali, che interagiscono con l'idrogel e si immobilizzano sulla superficie. Lavare con una soluzione di tempra alcalina che previene le interazioni proteiche non specifiche.

Dirigere la luce polarizzata sul chip. All'angolo di risonanza, gli elettroni metallici assorbono questa luce e risuonano, riducendo l'intensità della luce riflessa all'angolo riflesso corrispondente.

Il fotorivelatore raccoglie questa luce riflessa e il processore converte questo segnale in linea di base, generando un sensorgram, un grafico che rappresenta la risposta del sensore rispetto al tempo.

Far fluire una soluzione di agente antivirale nella cella a flusso. Durante il flusso, gli agenti antivirali interagiscono con i peptidi virali immobilizzati sul chip. Questa associazione modifica l'indice di rifrazione, che altera l'angolo e l'intensità della luce riflessa, determinando infine una risposta del sensore.

Aggiungere un tampone di lavaggio ad alta forza ionica che interrompe l'interazione tra le due molecole, portando alla loro dissociazione e diminuendo la risposta del sensore.

Analizzare la forma del sensorgram, e valutare l'associazione e la dissociazione delle due molecole cruciali nelle interazioni biomolecolari.

Per il sistema SPR a doppio canale, utilizzare HBS-EP+ come tampone di corsa, 10 millimolari di acido cloridrico glicina con pH compreso tra 1,5 e 1,6 come tampone di rigenerazione e accendere il degasatore dello strumento, l'autocampionatore e la pompa. Quindi, lavare l'intero sistema con acqua bidistillata per 1 ora.

Quindi, far cadere l'olio da immersione sul rivelatore e montare un chip sensore in vetro rivestito con un sottile film d'oro e, sul lato superiore, funzionalizzato con idrogel di carbossimetildestrano direttamente sul rivelatore sotto la cella di flusso a tre porte. Quindi, fissare l'impostazione tirando verso il basso la maniglia.

Per immobilizzare i ligandi proteici nei chip dei sensori, aprire una tabella di esecuzione facendo clic su Modulo nella barra dei menu ed eseguire l'editor di tabelle nel software SPRAutoLink integrato. Quindi, scegli e fai clic su BASIC_Immobilization dall'elenco delle tabelle di esecuzione disponibili e segui i passaggi della procedura sperimentale sullo schermo del computer.

Successivamente, fare clic su Editor set di campioni nella sezione Modulo per compilare l'elenco dei reagenti per due rack posizionati nell'autocampionatore per ulteriori analisi. Fare clic su Autosampler Sampler Direct Control come strumento nella barra dei menu per portare i rack avanti o indietro e scegliere 4 gradi Celsius come temperatura di esercizio.

Avviare la pompa per infondere acqua bidistillata facendo clic su Strumenti e "Controllo diretto della pompa " e registrare i dati facendo clic su "Controllo diretto dello strumento SPR" e, ogni volta, avviare nella finestra appena visualizzata. Dopo aver aggiunto i reagenti di accoppiamento in fiale da 300 microlitri, inserirli nei rack dell'autocampionatore e avviare la tabella di esecuzione facendo clic su Esegui.

Per la semplice interazione proteina-proteina dopo aver riempito la pompa a 25.000 microlitri al minuto, eseguire la regolazione della linea di base per 30 secondi. Attendere la successiva regolazione della linea di base con acqua bidistillata per 1,5 minuti prima di temprare la superficie del chip attivato con 1 molare di etanolammina cloridrato, pH 8,5. Quindi, passare le provette dal campionatore di liquidi al degasatore dall'acqua a doppia distillazione nella bottiglia con HBS-EP+.

Fare clic su Modulo, scorrere verso il basso e passare a "Post-elaborazione" facendo clic su questa modalità operativa. Quindi, fare clic su Aggiungi per selezionare le curve di legame generate nel tempo nel modulo del grafico dei dati per ogni cella di flusso ed esportare la sovrapposizione come file di scorrimento. Successivamente, fare clic su File per aprire le opzioni di salvataggio del file e ottenere le curve di risposta allineando le curve sinistra e destra e sottraendo i segnali del secondo canale di riferimento da quelli del canale del ligando.