Quantificazione dei mediatori infiammatori in cellule infette derivate da tessuti umani

Durante un'infezione, i linfociti attivati rilasciano mediatori infiammatori - citochine - per suscitare una risposta immunitaria.

Per quantificare i mediatori dell'infiammazione in un tessuto infetto, iniziare con una sospensione cellulare contenente cellule immunitarie derivate dal tessuto polmonare umano.

Incubare le cellule con Haemophilus influenzae, un batterio patogeno respiratorio. Gli antigeni di superficie dei batteri interagiscono con i recettori di riconoscimento dei modelli sulle cellule immunitarie fagocitiche. Questo avvia l'internalizzazione del batterio, la trasformazione in peptidi più piccoli e la presentazione del peptide da parte della principale molecola del complesso di istocompatibilità.

La molecola antigene-MHC-II sulle cellule fagocitiche si lega ai linfociti T attraverso i recettori delle cellule T, insieme alle interazioni dei recettori co-stimolatori, con conseguente attivazione dei linfociti T e produzione di citochine pro-infiammatorie.

Trattare le cellule con bloccanti del Golgi, che compromettono il rilascio di citochine, causando il loro accumulo all'interno delle cellule. Lavare le cellule con un tampone bloccante per bloccare i siti di legame non specifici.

Colorare la sospensione cellulare con un mix di anticorpi marcati con fluorofori che si legano specificamente ai marcatori della superficie dei linfociti T umani, consentendo la marcatura dei linfociti.

Fissare le cellule e permeabilizzarle con un tensioattivo che forma pori. Incubare le cellule permeabilizzate con anticorpi anti-citochine marcati con fluorofori, che entrano nelle cellule e interagiscono con citochine specifiche.

Utilizzando la citometria a flusso, misurare il segnale di fluorescenza delle citochine all'interno dei linfociti marcati, correlandosi con la produzione di mediatori infiammatori dovuta a un'infezione batterica.

Tagliare circa 20-40 grammi del campione di lobectomia in sezioni da 3 a 5 millimetri cubi. Posizionarli all'interno di una camera sterile da 50 microlitri e frammentare meccanicamente il tessuto utilizzando un apposito disaggregatore. Dopo la disaggregazione tissutale, lisare i globuli rossi come dimostrato e risospendere le cellule in RPMI sterile. Quindi, filtrare le cellule attraverso una rete di nylon sterile da 100 micrometri e contare il numero di cellule vitali utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano.

Per il test dell'infezione, risospendere le cellule polmonari in RPMI a una concentrazione finale di 4 milioni di cellule per millilitro per provetta. Quindi, infettare le cellule con un MOI di 100 batteri per cellula. Allentare il tappo di mezzo giro per consentire il trasferimento del gas nei tubi. Posizionare le cellule nel rotatore di provette e incubarle a 37 gradi Celsius, ruotando a 12 giri/min. Un'ora dopo la stimolazione, aggiungere Brefeldina A per prevenire l'esportazione extracellulare di citochine e incubare le sospensioni cellulari per altre 16-22 ore con rotazione.

Il giorno seguente, lavare la sospensione cellulare con 500 microlitri di PBS contenente l'1% di albumina sierica bovina e lo 0,01% di sodio azide. Successivamente, rimanere nella sospensione cellulare per specifici marcatori di superficie delle cellule linfocitarie umane per un'ora. Quindi, lavare le cellule con PBS e fissarle e permeabilizzarle, come dimostrato in precedenza. Successivamente, incubare le cellule con anticorpi intracellulari che colorano le citochine per un'ora. Quindi, lavare le cellule e risospenderle in 100 microlitri di PBS, prima dell'acquisizione dei dati su un citometro a flusso.