Quantificazione degli interferoni bioattivi di tipo I utilizzando un saggio reporter di fosfatasi alcalina alcalina embrionale secreta

Per quantificare gli interferoni bioattivi di tipo I, come l'interferone-alfa e l'interferone-beta, in un campione di prova, prelevare una piastra a più pozzetti contenente cellule reporter ingegnerizzate. Queste cellule esprimono il gene reporter della fosfatasi alcalina embrionale secreta, SEAP, sotto il controllo del promotore inducibile dall'interferone-alfa e beta.

Aggiungere il campione di prova contenente una concentrazione di interferone di tipo I sconosciuta. Pipettare una serie di concentrazioni di interferone umano di tipo I in altri pozzetti, che fungono da controlli standard. Incubare.

L'interferone di tipo I nel pozzetto del test si lega a uno specifico recettore della superficie cellulare, attivando le Janus chinasi. Queste protein chinasi fosforilano i trasduttori di segnale e gli attivatori della trascrizione, STAT, proteine, che dimerizzano e formano un complesso con uno specifico fattore di regolazione dell'interferone.

Entrando nel nucleo, il complesso si lega a una specifica sequenza di DNA nel promotore inducibile dell'interferone-alfa e beta, attivando la trascrizione genica SEAP e producendo gli enzimi SEAP, che vengono secreti nel terreno.

Trasferire il terreno contenente PAE in pozzetti per piastre multipozzetto con un substrato specifico per PAES. SEAP idrolizza il substrato rosa, producendo un prodotto di colore viola-blu.

Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare l'assorbanza del prodotto nei pozzetti di prova e standard, indicativa dei livelli di PAES e della concentrazione di interferone di tipo I.

Dalla curva standard dell'interferone di tipo I tracciata, determinare la concentrazione di interferone di tipo I bioattivo nel campione di prova.

Per misurare l'interferone bioattivo di tipo I utilizzando le cellule reporter di interferone alfa/beta HEK-Blue, in primo luogo, le cellule reporter devono essere piastrate a una densità di 50.000 cellule per pozzetto in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti fino a un volume finale di 180 microlitri. Quindi, aggiungere 20 microlitri del surnatante di co-coltura appena raccolto a ciascun pozzetto in duplicato. Includere una serie di controlli standard interni e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 18-22 ore.

Per determinare i livelli di fosfatasi alcalina rilasciata dalle cellule reporter, aggiungere 180 microlitri di soluzione QUANTI-Blue a ciascun pozzetto di una nuova piastra a fondo piatto. Quindi, aggiungere 20 microlitri di surnatanti indotti di interferone-alfa/beta blu HEK a ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius fino a quando il colore non si sviluppa nei pozzetti di controllo standard dell'interferone.

La soluzione QUANTI-Blue cambia da rosa a viola-blu in presenza dell'enzima. Infine, utilizzare uno spettrofotometro per valutare i livelli di fosfatasi alcalina secreta a 620-655 nanometri e determinare la concentrazione di interferone di tipo I mediante estrapolazione dalla parte lineare della curva standard dell'interferone.