High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare ed eseguire 384 piastre di saggi per l'analisi ad alto rendimento di un gruppo altamente omologo di geni, come i sottotipi di interferone di tipo uno e tre. Ciò si ottiene preparando prima la diluizione seriale standard utilizzata per l'esecuzione delle piastre di analisi. Successivamente, vengono preparate la sonda di innesco e le miscele di materiale di lavoro di controllo senza modello utilizzate per realizzare le lastre.

Quindi le piastre di analisi a 384 pozzetti vengono preparate utilizzando un pipettatore multicanale automatizzato e vengono essiccate per la conservazione. Infine, le 384 piastre di analisi dei pozzetti vengono analizzate. In definitiva, il test RT PCR R in tempo reale quantitativo ad alto rendimento viene utilizzato per definire le firme di espressione dell'interferone in modelli di coltura tissutale, studiando agenti patogeni o in campioni clinici nel contesto di malattie infettive o autoinfiammatorie.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la PCR quantitativa R 2, utilizzando sonde lineari standard o cyberg green, è che le sonde fluorescenti di acido nucleico beacon e lock molecolari possono essere utilizzate per discriminare le differenze di una singola coppia di basi tra sequenze altamente simili Dopo lo scongelamento, il vortice e la breve centrifugazione di uno spermatozoo standard e di salmone o S-S-D-N-A. Preparare la miscela di acqua SSD NA per i 17 set di diluizione standard mescolando 51 microlitri di S-S-D-N-A con 20,3 millilitri di acqua. Erogare 190 microlitri della miscela di acqua SS DNA nella prima provetta di una striscia PCR da otto provette e 180 microlitri nelle cinque provette successive.

Eseguire una diluizione da uno a 20 trasferendo 10 microlitri dallo stock standard 50 Picomolar alla provetta con 190 microlitri di vortice di miscela d'acqua S-S-D-N-A e centrifugare rapidamente. La striscia PCR esegue una diluizione da uno a 10 trasferendo 20 microlitri dalla provetta diluita più di recente alla provetta successiva della serie vortex e centrifuga rapidamente la striscia PCR. Ripetere la diluizione da uno a 10 fino a quando l'ultima provetta della serie non ha ricevuto lo standard.

Dopo aver etichettato fino a 17 provette da due millilitri, utilizzare una pipetta elettronica multicanale da 12,5 microlitri per aggiungere due microlitri di S-S-D-N-A a ciascuna provetta utilizzando primer e sonde preparate secondo il protocollo di testo. Aggiungere il primer in avanti, il primer inverso e la sonda appropriati a ciascun primer. Tubo di lavoro del set della sonda per preparare il controllo senza modello o le miscele di materiale di lavoro NTC.

Trasferire 14,3 microlitri di ciascuna sonda di primer impostata nella provetta di miscelazione NTC appropriata secondo questa tabella. Dopo la rimozione di un Eloqua dei set di sonde di innesco necessari per le miscele di lavoro NTC, 1,5 millilitri di acqua per portare il volume finale di ciascuna provetta di lavoro del set di sonde di innesco a 1,7 millilitri. Per preparare una piastra sorgente a 96 pozzetti dei set di sonde di primer e miscele NTC.

Posizionare una nuova piastra da 96 pozzetti in un blocco di raffreddamento raffreddato da 96 pozzetti e designare i pozzetti con il set di sonde di primer corretto o la miscela NTC utilizzando una pipetta elettronica multicanale da 250 microlitri. Aggiungere 66 microlitri di acqua a ogni set di sonde di innesco. Il pozzo eroga 82,5 microlitri di acqua ai quattro pozzi target 17

Erogare 27,5 microlitri di acqua in ogni miscela anti C. Quindi, aggiungere 54 microlitri delle sonde di innesco corrette al materiale di lavoro alle sonde di innesco designate al momento dell'erogazione dei pozzetti. 67,5 microlitri del target 17 primer Probe working set stock al target designato 17 sonde primer nei pozzi.

Aggiungere 22,5 microlitri della corretta miscela di materiale lavorante NTC nei pozzetti designati. Quindi utilizzare una guarnizione adesiva per sigillare la piastra a 96 pozzetti e centrifugare per un minuto a 700 Gs per assicurarsi che il contenuto sia sul fondo dei pozzetti con l'adattatore a 96 pozzetti. Mettere la piastra nel miscelatore a vortice e mescolare a 1000 RP per un minuto.

Quindi centrifugare la piastra a 700 G per cinque minuti. Per preparare le piastre per il dosaggio a 384 pozzetti, accendere il pipettatore multicanale automatizzato e fare doppio clic sull'icona del software per aprire il protocollo per la produzione di piastre per il dosaggio dell'interferone per la configurazione della piattaforma. Posizionare una scatola di puntali per pipette completamente piena nella posizione della piattaforma uno, la piastra sorgente da 96 pozzetti in posizione quattro e una nuova piastra da 384 pozzetti nella posizione sei.

Inizia la corsa premendo il pulsante di riproduzione al termine della corsa. Picchiettare delicatamente la piastra per il saggio a 384 pozzetti su una superficie piana per assicurarsi che i fluidi siano sul fondo dei pozzetti e applicare una guarnizione adesiva dopo aver fatto girare la piastra a 700 Gs per un minuto. Rimuovere la guarnizione della piastra adesiva.

Posizionare la piastra di analisi da 384 pozzetti nell'essiccatore a piastre e posizionare il collettore da 384 pozzetti direttamente sopra i pozzetti. Una volta che le 384 piastre di analisi sono asciutte, il contenuto è asciutto. Applicare un nuovo sigillo adesivo per piastra, un'etichetta in alluminio rapido e conservare al buio a quattro gradi Celsius fino all'uso per caricare ed eseguire la piastra di analisi.

Preparare due miscele di geni per la pulizia o HKG diluendo due microlitri di S-S-D-N-A in 84,9 microlitri di acqua. Quindi aggiungere due microlitri di SSD NA diluito 11,8 microlitri di acqua, 23 microlitri di master mix e 9,2 microlitri del corretto 20 XHKG primer Probe impostato su ciascuna provetta HKG etichettata, vortex e centrifugare brevemente dopo aver preparato i campioni e il CDNA di controllo positivo a 78,8 microlitri di master mix e 54,8 microlitri di acqua a ciascun campione da 24 microlitri e provetta di controllo positivo. Per preparare gli standard e le miscele di pozzetti NTC da aggiungere a una piastra di saggio essiccata da 384 pozzetti, aggiungere 165 microlitri di acqua a 275 microlitri di master mix in una provetta da 1,5 millilitri per la miscela NTC a 52,5 microlitri di acqua a 52,5 microlitri di master mix in una provetta da 1,5 millilitri.

Rimuovere una piastra di saggio a 384 pozzetti essiccata precedentemente preparata a una temperatura di quattro gradi Celsius e centrifugare a 700 GS per un minuto. Con la pipetta elettronica multicanale da 30 microlitri erogare 7,5 microlitri di NTC. Mescolare bene a ciascun NTC.

Erogare bene sei microlitri della miscela standard e 1,5 microlitri dello standard per ogni standard. A questo punto, erogare 7,5 microlitri di campione nei pozzetti designati con una pipetta elettronica multicanale da 12,5 microlitri. Erogare 2,5 microlitri di primer HKG La sonda si mescola nei pozzetti designati dopo aver utilizzato la pellicola adesiva ottica per sigillare la piastra e la centrifusione a 700 Gs per un minuto, vorticare la piastra sigillata a 384 pozzetti nel miscelatore a vortice a 2, 600 giri/min per due minuti e centrifugare a 700 formaggi per cinque minuti.

Infine, posizionare la piastra di analisi sigillata nella macchina Q-R-T-P-C-R. Aprire il modello per il layout del saggio e utilizzare le seguenti condizioni di reazione. Inizia l'esecuzione, esporta e analizza i dati secondo il protocollo di testo Come mostrato in questa figura, le firme di espressione dell'interferone umano di tipo uno e tre sono state analizzate in cellule mononucleate del sangue periferico o p BMC da sei donatori stimolati con ligandi del recettore toll-like.

I dati sono presentati come grafici radar in una scala logaritmica utilizzando due metodi di analisi, tra cui il valore CQ assoluto normalizzato al gene di housekeeping e il numero di copie del modello per microgrammo di RNA totale. I dati mostrano che le firme di espressione dell'interferone umano suscitate dagli agonisti del TLR sono firme di espressione specifiche del ligando dell'interferone di tipo uno e tre in Resus Maccas. Anche in questo esperimento sono stati specifici per i ligandi TLR, le PBMC di tre donatori sono state stimolate con tre ligandi per tre ore.

L'espressione del sottotipo di interferone nelle cellule non stimolate al basale era bassa, come mostrato qui. Un numero limitato di sottotipi di interferone alfa è stato espresso in risposta a LPS e poly ic. Al contrario, l'espressione dell'interferone in risposta all'imiquimod era elevata e l'espressione del sottotipo era un'espressione ampia dell'interferone beta e dell'interferone.

Lambda one è stato potenziato da tutti e tre gli agonisti TLR Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare, eseguire e analyze. 3D quattro piastre di dosaggio per l'analisi ad alto rendimento di un gruppo di geni molto simili come i sottotipi di interferone di tipo uno e tre.