Una tecnica in vitro per studiare l'interazione delle cellule T con i doppi strati lipidici planari supportati

Prendi un vetrino di flusso contenente un doppio strato lipidico supportato, o SLB.

L'SLB è coniugato a ligandi specifici - molecola di adesione intercellulare 1 o ICAM-1 e anticorpi anti-CD3 - marcati con fluorofori.

Aggiungi cellule T e anti-CD107a Fab marcato con fluoroforo, il frammento legante l'antigene di un anticorpo contro il marcatore di degranulazione.

Il complesso recettore-CD3 o TCR-CD3 delle cellule T si lega all'anticorpo anti-CD3, innescando il TCR.

La segnalazione inside-out indotta dall'innesco attiva le integrine sulla superficie, che si legano all'ICAM-1 immobilizzato.

La coniugazione induce la riorganizzazione del citoscheletro, il riarrangiamento dei microtubuli e la polimerizzazione dell'actina che porta alla diffusione laterale della cellula sulla superficie SLB.

La diffusione consente a più interazioni ligando-recettore di formare un cluster di attivazione supramolecolare o SMAC, creando una sinapsi immunitaria.

I granuli litici delle cellule T si muovono lungo i microtubuli e si fondono con la membrana plasmatica, esponendo i marcatori di degranulazione sulla superficie cellulare, che si legano all'anti-CD107a Fab.

Utilizzando un microscopio a fluorescenza, visualizza la sinapsi immunitaria arricchita in complessi TCR-CD3, integrine e marcatori di degranulazione.

Inizia usando una pinza a forbice in polipropilene per immergere i vetrini coprioggetti in una soluzione acida di piranha appena preparata per 25-30 minuti. Al termine del lavaggio, sciacquare i vetrini coprioggetti sette volte in un volume fresco di acqua ultrapura per ogni lavaggio e mettere da parte i vetrini coprioggetti bagnati per far scivolare via l'acqua rimanente dal bicchiere pulito.

Quando i vetrini coprioggetti sono asciutti, aliquotare due microlitri della miscela finale di liposomi, precisamente, al centro di un canale di scorrimento autoadesivo all'interno di una cappa a flusso sterile e, immediatamente ma con attenzione, allineare un vetrino coprioggetti pulito e asciutto con il vetrino per consentire al vetrino coprioggetti di essere abbassato delicatamente sul lato adesivo del vetrino e utilizzare l'anello esterno della pinza a forbice in polipropilene per applicare una leggera pressione al contatto periferico del vetrino coprioggetti con il vetrino, assicurandosi che il vetrino sia saldamente attaccato al vetrino per evitare perdite. Quindi, capovolgi la diapositiva e usa un pennarello indelebile per disegnare quattro punti attorno al doppio strato sul lato esterno del gruppo diapositiva.

Prima della prima iniezione, designare una porta del canale come porta di ingresso e l'altra come porta di uscita, mantenendo questa designazione per tutta la durata dell'esperimento. Per evitare la formazione di bolle, inserire l'estremità del puntale della pipetta direttamente nella porta di ingresso fino a quando non si avverte la penetrazione della guarnizione in gomma del canale di scorrimento con il puntale.

Riempire lentamente il canale con 50 microlitri di tampone di saggio caldo. Iniettare 200 microlitri di cloruro di nichel (II) in una soluzione bloccante la caseina nella porta di ingresso e rimuovere 50 microlitri di tampone dalla porta di uscita. Dopo un'incubazione di 45 minuti, rimuovere la soluzione di caseina in eccesso dalla porta di uscita.

Iniettare 100 microlitri di una soluzione di ICAM-1 e streptavidina nella porta di ingresso per un'incubazione di 45 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione proteica in eccesso dalla porta di uscita e lavare il doppio strato due volte con 100 microlitri di tampone per saggio. Quindi, etichettare i doppi strati con 100 microlitri di anticorpo anti-CD3 coniugato con fluorofori per 45 minuti a temperatura ambiente, seguiti da due lavaggi in 100 microlitri di tampone di saggio per lavaggio, come dimostrato.

Per visualizzare le interazioni cellula T-doppio strato, posizionare il vetrino sul tavolino riscaldato a 37 gradi Celsius di un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale, o TIRF, e regolare il tavolino utilizzando i segni di inchiostro per centrare il doppio strato sull'obiettivo di potenza 100.

Per l'imaging del rilascio dei granuli, aggiungere frammenti Fab di anticorpi anti-CD107a coniugati a fluorescenza alla sospensione delle cellule T CD4 e risospendere le cellule marcate in 50 microlitri di tampone per saggio per iniezione nella porta di ingresso del canale del vetrino. Quindi, selezionare il numero appropriato di campi sperimentali e registrare le immagini di ciascun campo una volta al minuto per 30 minuti dopo l'iniezione.