La tecnica di fotoconversione per esplorare la dinamica delle cellule infiammatorie nelle pupe di insetti

Inizia con un piatto con fondo di vetro contenente pupe di Drosophila transgeniche che trasportano epitelio ferito marcato con le loro proteine di superficie cellulare che mostrano fluorescenza verde.

Le cellule immunitarie delle pupe, o emociti, esprimono fluorofori verdi fotoconvertibili nel citoplasma e proteine fluorescenti rosse nel nucleo, facilitando il tracciamento cellulare.

Le cellule ferite rilasciano chemioattrattivi o molecole infiammatorie, attirando gli emociti verso il sito ferito.

La microscopia confocale rivela l'area ferita circondata da cellule epiteliali verdi.

Durante la guarigione, gli emociti verdi con nuclei rossi vicino alla ferita estendono le sporgenze della membrana - filopodi e lamellipodi e migrano verso l'area ferita.

Nel tempo, man mano che il chemioattrattivo si diffonde, gli emociti distanti migrano verso la ferita, creando un'onda di cellule immunitarie.

Illumina la sottopopolazione di emociti migratori con una lunghezza d'onda di 405 nanometri. Questo converte irreversibilmente il fluoroforo fotoconvertibile degli emociti da verde a rosso.

Questi emociti fotoconvertiti riparano l'epitelio ferito e si allontanano dal sito della ferita, differenziando gli emociti fotoconvertiti dagli emociti non fotoconvertiti e chiarendo le dinamiche cellulari infiammatorie.

Dopo aver avvolto i margini dell'ala della pupilla, trasferire rapidamente il piatto con fondo di vetro su un microscopio appropriato per l'imaging time-lapse. Quindi, apri il software di acquisizione delle immagini appropriato.

Nel software, accendi i laser appropriati e regola la loro potenza e l'offset del guadagno per ottenere un segnale fluorescente sufficiente senza saturazione dei pixel. In generale, la potenza laser più bassa possibile nell'intervallo dal 5% al 20% funziona meglio per ridurre al minimo il fotosbiancamento.

Concentrati sull'intera ala pupillare a basso ingrandimento o concentrati sulla ferita ad alto ingrandimento per studiare la riparazione della ferita. Per catturare sia l'epitelio riparatore che il reclutamento delle cellule infiammatorie, in primo luogo, impostare il microscopio per registrare uno z-stack utilizzando la regolazione fine della messa a fuoco sul pannello di controllo. Scansiona dall'epitelio ferito fino allo spazio extracellulare sottostante, contenente gli emociti migratori.

Quindi, imposta il software per registrare le z-slice attraverso l'ala pupillare ogni 3 micron o a intervalli ancora più stretti. Per l'imaging time-lapse, registrare gli z-stack almeno ogni 30 secondi per almeno un'ora.

Quando si utilizzano le sonde fotoconvertibili per fotoconvertire ed etichettare selettivamente un sottoinsieme di cellule durante l'imaging, aprire i moduli appropriati all'interno del software di imaging per eseguire la fotoconversione e attivare il laser a 405 nanometri. Quindi, seleziona le celle da fotoconvertire all'interno del software FRAP utilizzando uno strumento di selezione.

Quindi, imposta l'andamento temporale per la conversione delle foto su un singolo fotogramma di iterazione e imposta il laser a 405 nanometri al 20% di potenza del laser, quindi fai clic su Avvia l'esperimento per eseguire la conversione delle foto. Una volta completato, uscire dal modulo FRAP e tornare alla schermata di imaging originale. Lì, sintonizzare i laser sui fluorofori in uso e visualizzare le celle fotoconvertite e non fotoconvertite utilizzando registrazioni time-lapse.