Un metodo di immunofluorescenza per misurare la neutralizzazione del citomegalovirus umano

Assumere diluizioni seriali di anticorpi specifici per il citomegalovirus umano, o HCMV.

Dopo l'aggiunta di HCMV, gli anticorpi si legano alla glicoproteina B sull'involucro virale, neutralizzando il virus.

Trasferire la miscela su fibroblasti umani e incubare.

Un complesso di glicoproteine trimeriche sui virus non neutralizzati si lega a specifici recettori cellulari, innescando la fusione della membrana virus-ospite mediata dalla glicoproteina B e rilasciando il nucleocapside contenente DNA genomico all'interno.

Il genoma rilasciato entra nel nucleo, codificando proteine localizzate nel nucleo immediatamente precoce, o IE.

La neutralizzazione degli anticorpi impedisce l'ingresso virale nelle cellule.

Rimuovi i virus non internalizzati. Trattare con etanolo a una temperatura inferiore allo zero per fissare e permeabilizzare le cellule.

Introdurre un anticorpo primario che si lega alle proteine IE.

Aggiungere un anticorpo secondario coniugato con fluorofori che si lega all'anticorpo primario e una colorazione fluorescente che si lega al DNA.

Al microscopio, rileva le cellule con doppia colorazione infettate dal virus. Calcolare la percentuale di cellule infette per determinare la neutralizzazione del virus alle diverse concentrazioni di anticorpi.

Il giorno prima dell'esperimento, preparare le cellule bersaglio per l'infezione coltivando cellule di fibroblasti, coltivate in terreni completi, costituiti da DMEM integrato con il 10% di FBS, in una piastra sterile a 96 pozzetti.

Dopo 24 ore, preparare la miscela virus-anticorpo aggiungendo 90 microlitri di soluzione anticorpale diluita nei pozzetti di una piastra fresca a 96 pozzetti. Preparare diluizioni seriali della soluzione anticorpale utilizzando terreni completi.

Inoltre, aggiungere 60 microlitri della soluzione virale, prediluita in terreno completo, in ciascun pozzetto contenente anticorpi per generare varie concentrazioni delle miscele virus-anticorpi e incubare.

Ora, per infettare le cellule bersaglio, prendi la piastra seminata con i fibroblasti. Aggiungere 100 microlitri di diverse concentrazioni della miscela virus-anticorpo alle cellule e incubare la piastra bersaglio per 24 ore.

Dopo 24 ore, per rilevare l'infezione virale utilizzando l'immunofluorescenza, fissare le cellule con etanolo assoluto e incubarle in un congelatore a -20 gradi Celsius. Dopo il fissaggio, procedere con i passaggi successivi sul banco da laboratorio.

Pipettare 100 μl dell'anticorpo primario in tutti i pozzetti della piastra. Mettere il piatto a temperatura ambiente per un'ora.

Rimuovere la soluzione di anticorpi primari dai pozzetti. Aggiungere una miscela di anticorpi secondari coniugati con fluorofori e soluzione DAPI a tutti i pozzetti. Incubare la piastra per un'ora al buio e lavare la piastra.

Per quantificare l'infezione, visualizzare la piastra al microscopio e acquisire le immagini utilizzando i canali blu e rosso. Calcola la percentuale di infezione per pozzetto, come dettagliato nel protocollo di testo.