Un metodo basato sull'immunofluorescenza per la visualizzazione delle cellule del ciuffo nelle criosezioni di digiuno

Inizia con una piastra di coltura contenente criosezioni di digiuno di topo fissate in formalina e riempite di gelatina con cellule a ciuffo con microvilli apicali e soma a forma di bobina.

Lavare con un tampone contenente detersivo per permeabilizzare le membrane cellulari.

Aggiungere una soluzione alcalina per il recupero dell'antigene. Incubare per rompere i legami incrociati delle proteine indotte dalla fissazione, rivelando le proteine per la colorazione.

Applicare una soluzione bloccante per prevenire il legame non specifico degli anticorpi.

Sovrapposizione con anticorpi primari che hanno come bersaglio una proteina legante l'actina, specificamente fosforilata nelle cellule del ciuffo.

Rimuovere gli anticorpi non legati. Introdurre un mix di anticorpi secondari coniugati con fluorofori, colorante legante il DNA e coniugato colorante fluorescente falloidina.

Gli anticorpi secondari si legano agli anticorpi primari, il colorante falloidina-fluorescente coniuga l'actina e il colorante legante il DNA marca i nuclei cellulari.

Rimuovere i componenti non legati e aggiungere un tampone privo di detergenti.

Trasferire la sezione su un vetrino rivestito di adesivo, montandolo con i supporti.

Al microscopio confocale, le cellule verdi a forma di rocchetto con fluorescenza intensificata all'estremità luminale e una massa estesa di radichette rosse indicano la presenza di cellule a ciuffo.

Per preparare le sezioni di digiuno, inizia impostando sia la temperatura della camera del criostato che la temperatura dell'oggetto a meno 22 gradi Celsius. Posizionare il blocco di tessuto congelato in un crio-stampo nella camera del criostato per almeno 15 minuti. Dopo 15 minuti, tagliare il blocco a metà con una lama di rasoio per esporre la sezione trasversale del digiuno. Monta metà del blocco su un adattatore per criostato. Sezionare il digiuno ripieno di gelatina in sezioni spesse 30 micron. Utilizzare una pinza congelata per trasferire delicatamente le sezioni in un piatto di coltura da 35 millimetri contenente 3 millilitri di PBS.

Dopo aver lavato le sezioni tre volte per 5 minuti ciascuna con 3 millilitri di PBS-T, aggiungere 3 millilitri di soluzione di recupero dell'antigene appena preparata al piatto contenente le sezioni flottanti. Quindi, chiudere il coperchio, sigillare lo spazio tra il piatto e il coperchio con una striscia di nastro adesivo in vinile e incubare a 50 gradi Celsius in un incubatore di ibridazione per tre ore senza agitare.

Dopo l'immunocolorazione, trasferire la piastra delle sezioni colorate in PBS su un microscopio stereoscopico. Mettere 200 microlitri di PBS in una gocciolina al centro di un vetrino di vetro bianco rivestito di AMS. Quindi, utilizzare un puntale per pipetta P200 per trasferire una sezione di digiuno dalla piastra alla gocciolina.

Dopo aver regolato l'allineamento della sezione, aspirare tutto il PBS rimanente che circonda la sezione. Aggiungere 20 microlitri di terreno di montaggio acquoso e posizionare un vetrino coprioggetti sopra il supporto. Sigillare immediatamente i bordi del vetrino coprioggetto con un mezzo di montaggio a base di xilene e lasciare asciugare per due o tre ore prima di iniziare la microscopia confocale.