Una tecnologia di microarray peptidici per la profilazione della specificità degli anticorpi

Prendi un vetrino di microarray contenente peptidi istonici con modifiche post-traduzionali o PTM target e non target.

I peptidi vengono immobilizzati tramite biotina coniugata in punti specifici del vetrino funzionalizzato con streptavidina.

Le macchie contengono anche un fluoroforo verde immobilizzato coniugato con biotina, che facilita l'identificazione delle macchie.

Introdurre un tampone bloccante, prevenendo l'interazione anticorpale non specifica.

Rimuovere il tampone e centrifugare per asciugare il vetrino.

All'interno di un imprinter per cera, bordare l'array con cera.

Equilibrare l'array con un buffer di ibridazione.

Incubare con gli anticorpi primari specifici per un PTM bersaglio.

Introdurre anticorpi secondari rossi coniugati con fluorofori che si legano agli anticorpi primari.

Rimuovere gli anticorpi non legati e centrifugare per asciugare il vetrino.

Immagine del vetrino utilizzando uno scanner per microarray. La fluorescenza verde aiuta a identificare le macchie, mentre la fluorescenza rossa indica l'interazione PTM-anticorpo, dimostrando la specificità anticorpale.

Il riconoscimento del PTM target dimostra la specificità anticorpale, mentre il riconoscimento di PTM non target indica una cross-reattività anticorpale.

Guidati dalla mappa della piastra di origine, caricare da 1 a 2 microlitri di ciascuna caratteristica peptidica nei pozzetti designati di una o più piastre di piccolo volume da 384 pozzetti. Diluire ogni caratteristica dieci volte con 1x tampone di stampa di microarray proteico, integrato con albumina sierica bovina all'1% e 5 microgrammi per microlitro di biotina marcata con fluoresceina. Quindi, centrifugare le piastre a 500 volte g a temperatura ambiente per 2 minuti. Quindi, svuotare il contenitore dei rifiuti della stampante microarray. Riempire la soluzione di lavaggio nei contenitori dell'umidificatore con acqua distillata sterile. Immettere i parametri del vetrino dell'array nel software della stampante per microarray.

Impostare la procedura di lavaggio su un lavaggio di 1 secondo con una singola immersione, il post-lavaggio per riimmergere i perni cinque volte e l'umidità al 60%. Quindi, inserire i vetrini rivestiti di streptavidina nelle piastre del substrato. Caricare le piastre nell'elevatore delle piastre. Inserire le piastre sorgente nei supporti delle piastre e caricare i supporti nell'elevatore delle piastre sorgente. Eseguire il processo di stampa.

Quindi, rimuovere le piastre del substrato dallo strumento. Bloccare i vetrini stampati con 1x tampone di blocco del microarray proteico per 30 minuti agitando. Quindi, lavare i vetrini in soluzione salina tamponata con fosfato a temperatura ambiente a pH 7,6 per 10 minuti. Ripetere il lavaggio con un nuovo lotto di PBS. Asciugare i vetrini mediante centrifugazione per 30 secondi a temperatura ambiente.

Quindi, preriscalda una stampante per cera microarray a 85 gradi Celsius per 30 minuti o fino a quando la cera non si sarà sciolta. Quindi, inserire una diapositiva, con il lato stampato rivolto verso il basso, nel supporto e allineare il supporto con lo stampo dell'imprinter. Portare lo stampo a contatto con il vetrino e tenerlo premuto per due secondi. Quindi, rimuovere rapidamente il vetrino dal supporto e ispezionare i bordi in cera per verificare che gli array siano racchiusi correttamente. Conservare i vetrini divisi a 4 gradi Celsius in un luogo asciutto e buio.

Per iniziare la procedura di ibridazione, posizionare un vetrino di matrice partizionato in un piatto di plastica e coprire il vetrino con un tampone di ibridazione. Equilibrare il vetrino per 30 minuti a 4 gradi Celsius agitando a bassa velocità. Asciugare il vetrino facendolo girare in una centrifuga per vetrini a microarray a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 5 microlitri di ciascuna soluzione di anticorpi ptm istonici ad almeno due pozzetti dell'array e incubare a 4 gradi Celsius per un'ora.

Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione anticorpale e lavare l'array con PBS freddo tre volte, per 5 minuti ciascuna, a 4 gradi Celsius. Successivamente, incubare l'array in una soluzione di anticorpi secondari coniugati con colorante fluorescente per 30 minuti a 4 gradi Celsius, in assenza di luce. Lavare il vetrino tre volte con PBS freddo come prima.

Immergere l'array a temperatura ambiente 0,1x PBS per rimuovere i sali in eccesso e asciugare il vetrino mediante una breve centrifugazione a temperatura ambiente. Visualizzare il vetrino con uno scanner a microarray a una risoluzione di almeno 25 micron.