Valutazione dell'internalizzazione delle proteine di superficie bersaglio utilizzando un derivato della biotina

Trattare gli astrociti corticali di topo con un derivato della biotina scissibile.

Incubare a bassa temperatura per prevenire l'internalizzazione delle proteine e facilitare l'adesione della biotina alle proteine di superficie bersaglio.

Lavare e aggiungere un terreno caldo, quindi incubare per indurre l'internalizzazione delle proteine biotinilate.

Lavare e trattare con un agente riducente impermeabile alla membrana per scindere la biotina non internalizzata.

Aggiungere un reagente di tempra per fermare la reazione e lavare.

Raccogliere le cellule e centrifugare. Rimuovere il surnatante.

Aggiungere un tampone di lisi per lisare le cellule, rilasciando le proteine biotinilate non biotinilate e internalizzate.

Centrifugare per pellettare i detriti della cella.

Raccogliere il surnatante contenente proteine, aggiungere perle di streptavidina-agarosio e mescolare per catturare le proteine biotinilate.

Centrifugare per pellettare le perle e scartare il surnatante.

Aggiungere un tampone di carico e calore per denaturare e rilasciare le proteine dalle perline.

Esegui la proteina su un gel e trasferiscila su una membrana assorbente.

Rileva utilizzando anticorpi primari e secondari per visu