Valutazione dell'internalizzazione delle proteine di superficie bersaglio utilizzando un derivato della biotina

Trattare gli astrociti corticali di topo con un derivato della biotina scissibile.

Incubare a bassa temperatura per prevenire l'internalizzazione delle proteine e facilitare l'adesione della biotina alle proteine di superficie bersaglio.

Lavare e aggiungere un terreno caldo, quindi incubare per indurre l'internalizzazione delle proteine biotinilate.

Lavare e trattare con un agente riducente impermeabile alla membrana per scindere la biotina non internalizzata.

Aggiungere un reagente di tempra per fermare la reazione e lavare.

Raccogliere le cellule e centrifugare. Rimuovere il surnatante.

Aggiungere un tampone di lisi per lisare le cellule, rilasciando le proteine biotinilate non biotinilate e internalizzate.

Centrifugare per pellettare i detriti della cella.

Raccogliere il surnatante contenente proteine, aggiungere perle di streptavidina-agarosio e mescolare per catturare le proteine biotinilate.

Centrifugare per pellettare le perle e scartare il surnatante.

Aggiungere un tampone di carico e calore per denaturare e rilasciare le proteine dalle perline.

Esegui la proteina su un gel e trasferiscila su una membrana assorbente.

Rileva utilizzando anticorpi primari e secondari per visualizzare una banda proteica distinta, confermando il successo dell'internalizzazione delle proteine.

Per prima cosa, rimuovi le colture di astrociti dall'incubatrice e aspira il terreno. Quindi, lavare le cellule tre volte con 4 millilitri di CM-PBS raffreddato e posizionare i piatti su ghiaccio tritato. Aspirare il CM-PBS e quindi pipettare 3 millilitri di tampone di biotina in ogni piatto. Inclinare i piatti avanti e indietro alcune volte per assicurarsi che il buffer sia ben distribuito e lasciarli sul ghiaccio per 30 minuti.

Quindi, aspirare il tampone di biotina e sostituirlo con 5 millilitri di terreno caldo. Incubare un piatto di coltura a 37 gradi Celsius per 15 minuti e un secondo piatto alla stessa temperatura per 30 minuti. Lasciare un altro piatto a 4 gradi Celsius come campione a zero minuti.

Al termine del periodo di incubazione, scartare il terreno e lavare le cellule tre volte con 4 millilitri di CM-PBS refrigerato. Successivamente, aspirare il CM-PBS e quindi pipettare 6 millilitri di tampone riducente sulle cellule e lasciare il campione in ghiaccio per 15 minuti.

Quindi, sostituire il terreno con 6 millilitri di tampone riducente fresco e posizionare il campione sul ghiaccio per altri 15 minuti.

Questo passaggio è fondamentale in quanto il glutatione contenuto all'interno del tampone riducente scinde le porzioni di biotina rimaste sulla superficie cellulare. Ciò garantisce che solo le proteine internalizzate vengano polarizzate ed etichettate.

Successivamente, rimuovere la soluzione riducente e sostituirla con 6 millilitri di tampone di tempra. Lasciare il campione in ghiaccio per altri 15 minuti e ripetere ancora una volta la fase di tempra. Quindi, scartare il tampone di tempra e lavare le cellule tre volte con 4 millilitri di PBS raffreddato.

Aspirare il CM-PBS e quindi raschiare le cellule in 1 millilitro di PBS raffreddato utilizzando un sollevatore di cellule e trasferire la sospensione in una provetta da microcentrifuga. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 100 g per tre minuti. Dopo tre minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone di lisi.

Lasciare il campione sul ghiaccio per 30 minuti e vorticare ogni cinque minuti. Centrifugare il lisato a 14.000 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius per pellettare il detergente e i materiali solubili. Quindi, trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.

Utilizzando un puntale di pipetta tagliato, aggiungere 150 microlitri di liquame di agarosio streptavidina al lisato e incubarlo a 4 gradi Celsius per tre ore su uno shaker. Dopo tre ore, pellettare le perle di agarosio streptavidina mediante centrifugazione a 1.500 g per 30 secondi a 4 gradi Celsius. Risospendere le perle in 1 millilitro di tampone di lavaggio e farle oscillare per tre minuti a 4 gradi Celsius. Pellettare le perline e scartare il surnatante.

Ripetere questo processo altre quattro volte per ridurre al minimo il legame aspecifico delle proteine citosoliche non biotinilate. Quindi, pellettare le perle mediante centrifugazione a 1.500 g per 30 secondi a 4 gradi Celsius. Eliminare il tampone di lavaggio sovrastante e aggiungere 50 microlitri di tampone di caricamento 1x.

Rilasciare biotina e streptavidina dalle perle denaturando a 95 gradi Celsius. Questa frazione dovrebbe contenere solo proteine della superficie cellulare internalizzate. Quindi, separare l'input, la superficie cellulare e le frazioni non legate mediante SDS-PAGE e analizzare mediante Western blotting.