Imaging e quantificazione di aggregati proteici in cervelli di Drosophila geneticamente modificati

Inizia con i cervelli di Drosophila geneticamente modificati. Questi cervelli esprimono una proteina mutante marcata con fluorescenza rossa nel neurone che può diffondersi alla cellula gliale circostante, esprimendo la proteina normale marcata con fluorescenza gialla, causando la loro aggregazione.

Aggiungere una soluzione fissativa che preservi l'integrità cellulare.

Rimuovere il fissativo e lavare con un tampone.

Aggiungere un reagente anti-dissolvenza e incubare per evitare lo sbiadimento dei segnali fluorescenti.

Trasferire le cervella su un vetrino e rimuovere il liquido in eccesso.

Lascia che il cervello aderisca al vetrino.

Usando piccoli pezzi di un vetrino coprioggetti come distanziatori, posiziona un vetrino coprioggetti sopra di essi. Aggiungere il reagente antisbiadimento e sigillarlo.

Con un microscopio confocale, acquisisci immagini utilizzando diverse lunghezze d'onda di eccitazione per la fluorescenza rossa e gialla.

Utilizzando un software di analisi delle immagini, quantificare gli aggregati proteici.

La co-localizzazione della fluorescenza rossa e gialla indica la diffusione di proteine mutanti.

Una volta che tutti i cervelli sono stati sezionati, trasferire la provetta di raccolta in un nutatore a temperatura ambiente e farli oscillare per circa 5 minuti. Dopo il periodo di fissazione, rimuovere la maggior parte della soluzione fissativa utilizzando una pipetta P1000 e gettarla, facendo molta attenzione a lasciare il cervello nelle provette. Ciò richiede un'aspirazione delicata e un'attenta osservazione.

Quindi, aggiungi 1 millilitro di PBST fresco al cervello. Copri il tubo e lascialo oscillare sul nutatore per circa un minuto per lavare via il fissativo rimasto. Quindi, rimuovere la soluzione e ripetere questa breve fase di lavaggio.

Seguire i due lavaggi brevi con un lavaggio di 5 minuti, poi tre lavaggi di 20 minuti e, infine, un singolo lavaggio di 1 ora. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere con cura la maggior parte del PBST e immergere il cervello in 30 microlitri di reagente anti-sbiadimento a base di glicerolo. Quindi, incubare il cervello a 4 gradi Celsius al buio senza movimento per 1-24 ore.

Successivamente, rimuovere i cervelli dalla provetta di raccolta utilizzando una punta di pipetta smussata e trasferirli su un vetrino da microscopio. Quindi, orientare delicatamente il cervello secondo necessità per l'imaging utilizzando il forcipe. È possibile montare più campioni sullo stesso vetrino in file separate.

Quindi, rimuovere il reagente anti-sbiadimento in eccesso dal vetrino utilizzando l'angolo di un fazzoletto da laboratorio piegato. Non lasciare che il tessuto entri in contatto con il cervello. Quindi, lasciare i campioni al buio per 5-10 minuti per consentire al cervello di aderire al vetrino.

Quindi, prendi piccoli pezzi di vetro di copertura rotto e posizionali attorno al cervello, coprendo un'area di circa 19 millimetri quadrati. Quindi, abbassa delicatamente un vetro di copertura di 22 millimetri quadrati sul mosaico di cervelli e vetro per creare un supporto a ponte. Quindi, erogare lentamente un nuovo reagente anti-sbiadimento sotto il vetrino coprioggetti in modo che riempia gli spazi vuoti. Fallo con molta attenzione in modo che il cervello e il vetro rimangano al loro posto. Quindi, sigillare il vetrino coprioggetti con lo smalto per unghie. Per prima cosa, basta applicarlo agli angoli. Lasciare asciugare i tamponi angolari da 5 a 10 minuti prima di completare la sigillatura lungo i bordi. I cervelli dovrebbero essere sottoposti a imaging il prima possibile.

Visualizzare i cervelli montati utilizzando un microscopio confocale dotato di un obiettivo a olio 40x o 63x per raccogliere z-slice nella regione del cervello in cui sono espressi i transgeni. Quindi, analizza i dati quantificando i puncta nelle singole z-slice o, in alternativa, dopo aver eseguito il rendering delle slice in tre dimensioni.

Per quantificare gli aggregati mutanti di Huntington che sono ben separati e hanno poco segnale di fondo, aprire la serie z confocale nella modalità di visualizzazione 3D. Quindi, utilizzare l'Analisi guidata per identificare i singoli punti in un canale selezionato.

Nelle impostazioni, regola la soglia e i filtri per rappresentare accuratamente tutti gli aggregati di dimensioni eterogenee come singoli oggetti nell'immagine. Quindi, abilitare Dividi oggetti in Prefiltro elaborazione binaria per separare gli aggregati strettamente associati. Le informazioni quantitative sugli oggetti identificati dal software sono riportate in Misure.

Dopo aver contato i puncta, caratterizzarli ulteriormente nel software di analisi delle immagini. Ad esempio, è possibile effettuare misurazioni pertinenti dei punti o delle superfici per ottenere informazioni sul diametro, il volume o l'intensità dell'aggregato. Alcuni aggregati di Huntington wild-type possono essere quantificati muovendosi manualmente attraverso lo z-stack e contando i punti verdi che sono distinguibili dal segnale diffuso circostante.

Fare attenzione a evitare di contare due volte i singoli aggregati quando compaiono in più di una fetta. Un'altra analisi di interesse è la determinazione della frequenza di co-localizzazione tra gli aggregati di Huntington Q25-YFP e Huntington Q91-mCherry. A tale scopo, utilizzare il conteggio manuale spostando fetta per fetta attraverso uno z-stack confocale.