Misurazione dell'attività del proteasoma in diversi compartimenti subcellulari del cervello di ratto
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
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Iniziare con le frazioni nucleari e sinaptiche subcellulari raccolte dall'amigdala laterale del cervello di ratti di controllo e condizionati dalla paura.
Ogni frazione subcellulare contiene concentrazioni variabili di proteasomi 20S, il nucleo catalitico del complesso proteasoma responsabile della degradazione delle proteine cellulari indesiderate.
Aggiungere ai campioni un tampone di saggio contenente ATP e un substrato peptidico fluorogenico e incubare.
In presenza di ATP, il proteasoma scinde il peptide fluorogenico, rilasciando molecole fluorogeniche libere.
Utilizzando un lettore di piastre, misurare l'intensità della fluorescenza a intervalli regolari.
Quantificare la fluorescenza confrontandola con le concentrazioni standard note della molecola fluorogenica.
L'intensità della fluorescenza è proporzionale all'attività del proteasoma nel campione.
L'aumento dell'attività del proteasoma nella frazione nucleare dei ratti condizionati dalla paura suggerisce cambiamenti nell'espressione genica correlata alla memoria, mentre la diminuzione dell'attività nella frazione sinaptica indica cambiamenti nell'espressione proteica sinaptica necessari per il mantenimento della memoria a lun
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