Misurazione dell'attività del proteasoma in diversi compartimenti subcellulari del cervello di ratto

Iniziare con le frazioni nucleari e sinaptiche subcellulari raccolte dall'amigdala laterale del cervello di ratti di controllo e condizionati dalla paura.

Ogni frazione subcellulare contiene concentrazioni variabili di proteasomi 20S, il nucleo catalitico del complesso proteasoma responsabile della degradazione delle proteine cellulari indesiderate.

Aggiungere ai campioni un tampone di saggio contenente ATP e un substrato peptidico fluorogenico e incubare.

In presenza di ATP, il proteasoma scinde il peptide fluorogenico, rilasciando molecole fluorogeniche libere.

Utilizzando un lettore di piastre, misurare l'intensità della fluorescenza a intervalli regolari.

Quantificare la fluorescenza confrontandola con le concentrazioni standard note della molecola fluorogenica.

L'intensità della fluorescenza è proporzionale all'attività del proteasoma nel campione.

L'aumento dell'attività del proteasoma nella frazione nucleare dei ratti condizionati dalla paura suggerisce cambiamenti nell'espressione genica correlata alla memoria, mentre la diminuzione dell'attività nella frazione sinaptica indica cambiamenti nell'espressione proteica sinaptica necessari per il mantenimento della memoria a lungo termine.

Per impostare il test, preriscaldare il lettore di piastre a 37 gradi Celsius e tenerlo premuto per tutta la seduta. Impostare l'eccitazione su 360 nanometri e l'emissione su 460 nanometri. Se la piastra a 96 pozzetti utilizzata è chiara, impostare la posizione dell'ottica su Bottom. Se si utilizza una piastra scura a 96 pozzetti, impostare la posizione dell'ottica su Superiore. Programmare una corsa cinetica con il tempo di 2 ore, scansione ogni 30 minuti.

Ricostituire il tampone di analisi 20s 10x fornito nel kit con 13,5 millilitri di acqua ultrapura. Aggiungere 14 microlitri di ATP da 100 millimolari al tampone ora 1x. Ciò migliora significativamente l'attività del proteasoma nei campioni e migliora l'affidabilità del test. Ricostituire lo standard AMC fornito nel kit con 100 microlitri di DMSO. Eseguire i passaggi utilizzando lo standard AMC al buio o in condizioni di scarsa illuminazione, poiché lo standard è sensibile alla luce.

Crea una curva standard di AMC da una serie di concentrazioni di AMC da alta a bassa. Questa curva sarà utilizzata per la calibrazione del lettore di piastre e l'analisi dell'attività del proteasoma nei campioni omogeneizzati. Ricostituire il substrato del proteasoma fornito nel kit con 65 microlitri di DMSO. Eseguire questo passaggio anche al buio o in condizioni di scarsa illuminazione, poiché il substrato è sensibile alla luce.

Quindi creare una diluizione da 1 a 20 del substrato del proteasoma in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri, utilizzando un tampone di saggio 20 S. Aggiungere una quantità normalizzata dei campioni desiderati a una piastra a 96 pozzetti. Eseguire ogni campione in duplicato. La quantità di campione necessaria varia in base alla preparazione del tessuto. Generalmente, da 10 a 20 microgrammi sono sufficienti per qualsiasi frazione subcellulare.

Portare il volume del pozzetto del campione a 80 microlitri con acqua ultrapura. La quantità aggiunta dipende dal volume di campione aggiunto. In due pozzetti separati, aggiungere 80 microlitri di acqua da sola. Questi saranno i bianchi del saggio. Aggiungere 10 microlitri di tampone per saggio 20 S a ciascun pozzetto, compresi i bianchi per il saggio. Utilizzare un ripetitore o una pipetta automatica per garantire un volume di analisi costante in tutti i pozzetti.

Spegni le luci o entra in una stanza buia. Aggiungere tutti i 100 microlitri di standard AMC diluiti in un nuovo pozzetto, utilizzando un singolo pozzetto per ogni standard. Al buio, utilizzare un ripetitore o una pipetta automatica per aggiungere 10 microlitri di substrato di proteasoma diluito ai pozzetti contenenti campioni e saggi bianchi, ma non lo standard AMC. Posizionare la piastra nel lettore di piastre e avviare la corsa cinetica.