JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
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Fissare un tubo endoteliale arteriolare prelevato dal cervello di un topo in una camera con un flusso tampone continuo.
Posizionare la camera in una configurazione di registrazione.
Introdurre un colorante fluorescente sensibile al calcio. Incubare per consentire l'assorbimento cellulare del colorante.
Lavare per rimuovere eventuali coloranti non internalizzati.
Inserire un elettrodo in una cellula endoteliale e registrare il potenziale di membrana a riposo.
Aumentare la temperatura del bagno a una temperatura fisiologica per facilitare il legame intracellulare del calcio al colorante.
Eccitare il colorante e misurare la fluorescenza per quantificare i livelli di calcio cellulare di base.
Introdurre un farmaco che si lega a specifici recettori accoppiati a proteine G sulle cellule endoteliali, avviando una cascata di segnalazione.
Questa cascata rilascia ioni calcio dal reticolo endoplasmatico nel citoplasma, migliorando il legame calcio-colorante e la fluorescenza.
Elevati livelli citoplasmatici di calcio attivano anche i canali del potassio, facilitando l'efflusso di ioni potassio e diminuendo il potenziale di membrana.
Registrare i dati.
L'aumento della fluorescenza e la diminuzione del potenziale di membrana indicano un tubo endoteliale funzionale.
Per misurare il potenziale della membrana endoteliale, mentre guardi attraverso l'obiettivo dei quattro tempi, posiziona attentamente la punta affilata dell'elettrodo appena sopra una cella del tubo endoteliale arterioso nella soluzione salina fisiologica che scorre con un micromanipolatore. Gradualmente, aumentare l'ingrandimento fino a 400 volte e riposizionare la punta dell'elettrodo secondo necessità. Utilizzando il micromanipolatore, inserire delicatamente la punta di un elettrodo affilato in una delle cellule del tubo endoteliale e iniziare a registrare la VM utilizzando un elettrometro.
Una volta che il VM endoteliale a riposo è stabile da meno 30 a meno 40 millivolt, applica gli agenti farmacologici desiderati per obiettivo sperimentale. Caricare il tubo endoteliale con il tracker di fluorescenza per la membrana plasmatica o l'organello desiderato a 37 gradi Celsius per 15-30 minuti. Lavare le cellule con una soluzione salina fisiologica di superfusione fresca e visualizzare le cellule vive al microscopio alla lunghezza d'onda di eccitazione dei rispettivi coloranti.