Analisi ultrastrutturale di una sezione cerebrale di topo mediante microscopia elettronica a trasmissione

Prendete una sezione di cervello di topo fissata con tetrossido di osmio incorporata in un blocco di resina.

Ottenere un'immagine di sezione e allinearla con un'immagine dell'atlante pre-preparata per identificare la regione di interesse.

Segna i confini di questa regione sul blocco.

Riscaldare la resina per ammorbidirla e asportare la regione contrassegnata.

Incollare il campione su una barra di supporto del vetro e tagliarlo.

Utilizzando un ultramicrotomo, preparare sezioni semisottili e ultrasottili.

Trasferire le sezioni semisottili e ultrasottili rispettivamente su supporti di vetro e griglie di nichel.

Colorare le sezioni semisottili con un colorante che si lega agli acidi nucleici, al citoplasma ricco di ribosomi e alla matrice extracellulare.

Lavare le sezioni ed esaminarle al microscopio ottico per confermare la presenza dell'area target.

Osservare le sezioni ultrasottili al microscopio elettronico a trasmissione.

Il tetrossido di osmio migliora la densità elettronica delle membrane cellulari e degli organelli, fornendo un elevato contrasto contro il citoplasma meno denso di elettroni, consentendo la visualizzazione dell'ultrastruttura cellulare.

Per mappare un'area di interesse, selezionare un'immagine contenente l'area di interesse dall'atlante di immagini precedentemente preparato. Disegna i bordi dell'area di interesse sull'immagine sezionata. Sovrapporre otticamente questi bordi al campione incorporato al microscopio e utilizzare un ago da 26 gauge da un pollice per graffiare questi bordi della regione sul campione di resina. Quindi, riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per ammorbidire la resina.

Quindi, estrai i campioni di resina calda dal forno e usa una lama di rasoio per asportare le aree di interesse. Incollare i campioni su barre di supporto in vetro acrilico del calibro appropriato e tagliare i campioni montati per il sezionamento semi e ultra sottile. Utilizzare un ultramicrotomo per acquisire sezioni semisottili da 0,7 micrometri e ultra sottili da 70 nanometri, raccogliendo le sezioni semisottili su supporti di vetro e le sezioni ultra sottili su griglie di nichel.

Colorare le sezioni semisottili con blu di toluidina all'1% in PBS per quattro minuti, seguito da diversi lavaggi in acqua deionizzata prima di esaminare le sezioni al microscopio ottico. Le sezioni ultrasottili possono quindi essere valutate direttamente mediante microscopia elettronica a trasmissione a 180 kilovolt, senza ulteriori modifiche.