Trasferimento genico assistito da elettroporazione incorporato in agarosio nei progenitori degli interneuroni corticali di topo

Riempire una micropipetta con una miscela di DNA contenente vettori plasmidici che trasportano il gene di interesse e un colorante tracciante. Fissarlo in un micromanipolatore.

Posizionare un blocco di agarosio al microscopio e posizionare sopra una fetta di cervello embrionale di topo incorporata nell'agarosio con interneuroni corticali.

Abbassare la micropipetta e iniettare la miscela di DNA nella regione progenitrice dell'interneurone. Il colorante tracciante contrassegna il sito di iniezione.

Posizionare un altro blocco di agarosio su un elettrodo a piastra di Petri e una colonna di agarosio sull'elettrodo di copertura.

Trasferire la fetta sul blocco e allineare l'elettrodo di copertura sul sito di iniezione.

Applicare brevi impulsi elettrici per permeabilizzare temporaneamente le membrane cellulari, consentendo ai plasmidi di entrare nel nucleo.

Incubare la fetta in un terreno per mantenere la vitalità cellulare.

All'interno del nucleo, il plasmide innesca l'espressione genica, produce la proteina bersaglio e modula le funzioni progenitrici degli interneuroni.

Per l'iniezione, miscelare il DNA del vettore di espressione e di controllo a una concentrazione di 1 microgrammo per microlitro per ciascun vettore e aggiungere una soluzione madre verde veloce a una diluizione da 1 a 10. Riempire una micropipetta di vetro di 0,5 millimetri di diametro interno e 1 millimetro di diametro esterno con 10 microlitri di miscela di DNA e caricare la micropipetta in un iniettore pneumatico a pompa pico. Posizionare il blocco più grande di agarosio sotto uno stereomicroscopio e posizionare la fetta da iniettare sul pezzo di agarosio.

Quindi, iniettare volumi da 25 a 50 nanolitri nella regione di eminenza gangliare mediale o caudale selezionata della fetta. Immediatamente dopo l'iniezione, posizionare il piccolo blocco di agarosio sull'elettrodo a piastra di Petri e utilizzare una micro spatola a estremità piatta per collegare la colonna di agarosio all'elettrodo di copertura mobile.

Trasferire la fetta iniettata con la sua membrana di supporto sul blocco di agarosio e posizionare l'elettrodo superiore con la colonna di agarosio sopra la regione selezionata della fetta. Quindi elettroplaccare la regione con due impulsi di 5 millisecondi a 125 volt, a 500 millisecondi di distanza. Dopo l'elettroporazione, riposizionare la fetta con la sua membrana di supporto nel suo piatto di supporto e rimettere il piatto nell'incubatore di coltura tissutale.